基于RNA测序揭示不同免疫特征绵羊胃肠道线虫感染中剪接位点功能INDELs的作用机制

《Scientific Reports》：Uncovering functional INDELs responsible for splice sites in sheep with different immune profiles naturally exposed to gastrointestinal nematode infection

本研究针对绵羊胃肠道线虫(GIN)感染导致的免疫机制不清问题，通过RNA测序技术分析不同应激反应表型绵羊肝脏组织，鉴定出4,594个与剪接位点效应(SSE)相关的INDELs，发现补体终末途径和STAT6、CFI等关键基因在免疫应答中发挥重要作用，为解析绵羊抗寄生虫感染的遗传基础提供了新视角。

　　

在全球绵羊养殖业中，胃肠道线虫(GIN)感染一直是导致高发病率和死亡率的主要元凶。这些寄生虫不仅引起动物体重下降、腹泻、低蛋白血症等症状，更造成严重的经济损失。尽管驱虫药物的使用一度是控制寄生虫的主要手段，但过度依赖导致耐药性问题日益突出，加之药物残留对食品和环境安全的威胁，迫使人们寻求更可持续的防治策略。

遗传育种作为综合防治方案的重要组成部分，其有效性建立在深入了解宿主抗性遗传机制的基础上。然而，绵羊对GIN感染的免疫应答遗传基础极为复杂，涉及多基因调控网络，且不同研究之间的结论存在较大差异，这使得抗性育种工作面临巨大挑战。

在这项发表于《Scientific Reports》的研究中，研究人员独辟蹊径，选择具有不同先天免疫应答特征的绵羊作为研究对象。这些动物根据应激反应水平被分为高应激反应组(HSR)和中等应激反应组(MSR)，通过在污染牧场自然感染GIN，模拟真实养殖环境中的感染情况。

研究团队特别关注了一种特殊类型的遗传变异——插入缺失(INDELs)，尤其是那些可能影响基因剪接位点的功能变异。基因剪接是基因表达过程中的关键环节，负责精确切除前体mRNA中的内含子，将外显子连接成成熟mRNA。剪接位点的突变可能导致外显子跳跃、内含子保留等异常剪接事件，进而影响蛋白质功能。在人类研究中，剪接位点突变已被证实与多种免疫相关疾病有关，但在动物研究中，这一领域的探索相对有限。

为了开展这项研究，研究人员采用了几个关键技术方法：首先，他们使用RNA测序(RNA-Seq)技术对16只绵羊（6只HSR、6只MSR和4只未暴露于GIN的对照动物）的肝脏组织进行转录组分析；其次，通过生物信息学方法进行变异检测，特别关注INDELs及其功能后果预测；最后，利用功能注释和通路富集分析识别与免疫应答相关的关键基因和信号通路。

变异检测在高应激反应组、中等应激反应组和GIN未暴露组中的结果

研究共鉴定出146,403个INDELs，其中导致氨基酸改变(AAC)和剪接位点效应(SSE)的变异分别为8,248和9,420个。绝大多数(99.9%)变异被归类为新发现变异，这一比例高于文献中通常报道的值，可能与研究的变异类型（剪接位点INDELs）、组织特异性（肝脏）以及参考基因组版本有关。

变异后果分析显示，主要类别包括剪接区域变异(26%)、移码变异(24%)、下游基因变异(10%)、剪接供体变异(10%)、上游基因变异(9%)和内含子变异(9%)。其中剪接供体和移码变异被归类为"高"影响，意味着这些变异很可能破坏蛋白质功能。

暴露组与GIN未暴露组的变异检测、基因注释和富集代谢通路

研究人员特别比较了暴露组（HSR和MSR特有INDELs组合）与免疫控制动物（GIN未暴露）之间的差异，以了解暴露和未暴露动物之间与免疫系统相关的特定基因和代谢通路。

暴露组共鉴定出73,548个INDELs，其中4,594个导致SSE。GIN未暴露组鉴定出19,610个INDELs，1,396个负责SSE。

暴露组和GIN未暴露组中导致SSE的INDELs分别得到1,162和431个基因（图3）。功能分析显示，暴露组有七个与免疫系统相关的显著富集代谢通路（FDR<0.05），主要涉及核因子κB(NF-κB)激活和抗原交叉呈递过程，同时"中性粒细胞脱颗粒"通路也被识别。相比之下，GIN未暴露组未发现与免疫系统相关的富集代谢通路，这与该组未暴露于GIN感染、免疫系统未受刺激的情况相符。

高应激反应组与中等应激反应组中的变异检测、基因注释和富集代谢通路

对HSR和MSR组的进一步分析显示，两组分别鉴定出1,614和2,980个导致SSE的INDELs。这些INDELs分别对应514和855个相关基因（图5）。

有趣的是，显著富集的免疫系统相关代谢通路仅在MSR组中被识别（表3），包括抗原交叉呈递和NF-κB相关通路。这可能表明MSR动物在面对应激源时表现出更正常的反应，需要激活更多基因和代谢通路来对抗自然感染。

MSR组中发现的抗原交叉呈递相关通路包括"可溶性外源抗原的交叉呈递（内体）"、"ER-吞噬体通路"和"抗原加工-交叉呈递"，这些通路与树突状细胞通过不同机制交叉呈递抗原有关。NF-κB相关通路包括"TNFR2非经典NF-κB通路"、"Dectin-1介导的非经典NF-κB信号"等，表明NF-κB在绵羊对GIN感染的免疫应答中可能发挥重要作用。

特别值得注意的是，MSR组中发现了多个补体系统基因（CFD、C5、C6、C8A、C9）和调控机制相关基因（CFI、C4BPA、C4BPB）。其中CFI基因编码一种蛋白酶，负责切割C3b和C4b，防止C3和C5转化酶的形成。该基因先前已在抗性绵羊系中被识别为差异表达基因。本研究在CFI基因中发现了两个新的单碱基插入，这些插入对该基因的所有七个转录本产生了影响，其中一个插入对大多数转录本具有高影响，后果为移码变异和剪接区域变异。

STAT6基因是另一个重要发现，该基因在IL-4和IL-13激活下参与多种T细胞应答、Th2反应发育和IL-4释放。在绵羊蠕虫感染免疫应答中，Th2反应是主要应答方式。STAT6基因中发现的插入具有高影响的剪接受体变异后果。

研究局限性与影响

本研究存在两个主要局限性：首先，动物在11月初（加拿大秋季末）实施安乐死，此时天气较凉，湿度较低，牧场寄生虫负荷减少，寄生虫可能处于休眠状态，因此RNA测序数据更反映感染的消退期而非高峰期。其次，使用肝脏组织而非皱胃、淋巴结或小肠组织进行RNA测序，虽然肝脏在急性期反应中发挥作用，但可能不如直接感染部位组织能全面反映免疫应答。

研究结果表明，影响抗原交叉呈递和NF-κB相关通路中基因剪接位点的INDELs可能参与绵羊对GIN感染的免疫应答。特别是，绵羊免疫系统可能使用交叉呈递作为抗原呈递的替代途径，而NF-κB可能在GIN感染期间的免疫系统激活和调控中发挥主要作用。"补体终末途径"的识别表明该通路可能有助于GIN感染的消退。

结论

本研究在不同先天免疫特征的自然暴露于GIN感染的绵羊中鉴定出4,594个导致剪接位点效应的INDELs，在GIN未暴露组中鉴定出1,396个INDELs。这些INDELs分别对应1,162和431个基因。多个通路被识别为富集，包括可能与GIN感染炎症反应相关的免疫系统通路，如"补体终末途径"。此外，STAT6和CFI等重要基因可能在GIN感染免疫应答中发挥主要作用，值得进一步研究。这些发现为理解绵羊抗寄生虫感染的分子机制提供了新见解，对绵羊抗病育种具有重要指导意义。