环境光剥夺通过扰乱Leydig细胞成熟与昼夜节律协调机制损害雄性大鼠生殖发育

《Scientific Reports》：Environmental light deprivation disrupts Leydig cell maturation and male reproductive development in rats

语 本研究针对现代社会中光污染、轮班制等导致的昼夜节律紊乱对男性生殖健康的潜在威胁，通过建立大鼠持续黑暗（DD）模型，系统揭示了环境光剥夺如何通过干扰下丘脑-垂体-睾丸轴激素节律、抑制Leydig细胞关键固醇生成基因（如Star、Cyp17a1）、破坏线粒体功能（ATP合成与膜电位解耦）及昼夜节律核心基因（Bmal1、Per2）表达，最终延迟精子发生关键标志物（Tnp1、Prm2）表达并降低精子功能。该研究为光环境调控男性青春期发育及生育力提供了分子机制新见解。

　　

在自然界中，日出日落的光照周期是生物体同步内部昼夜节律的核心环境线索。然而，随着现代社会人工光照的普及、轮班工作的增多以及极地长夜环境的存在，生物体可能长期处于异常光环境中。这种昼夜节律的紊乱已被发现与多种内分泌代谢疾病相关，但其对雄性生殖系统发育，特别是青春期关键细胞——Leydig细胞（睾丸间质细胞）成熟过程的影响，尚缺乏深入阐释。Leydig细胞作为睾酮合成的主要场所，其正常分化与功能建立对雄性第二性征出现、精子发生及生育力维持至关重要。该过程受到下丘脑-垂体-睾丸轴的精密调控，并与线粒体能量代谢、细胞自主的昼夜钟基因表达紧密偶联。

为探究环境光剥夺对雄性生殖发育的影响，塞尔维亚诺维萨德大学（University of Novi Sad）的Dijana Z. Travicic、Alisa P. Becin、Du?an Lalo?evi?、Silvana A. Andri?及Tatjana S. Kostic团队在《Scientific Reports》上发表研究，通过建立大鼠从出生后第21天（postnatal day 21, pnd 21）起持续黑暗（constant darkness, DD）暴露的模型，并在pnd 35（幼年期）、pnd 42（围青春期）和pnd 90（成年期）这三个关键发育时间点，系统评估了动物行为节律、激素水平、Leydig细胞基因表达、线粒体功能及精子参数等多维度指标。

研究采用的主要技术方法包括：利用跑轮系统连续监测大鼠自发活动以评估昼夜节律；通过放射免疫分析（RIA）和酶联免疫吸附试验（ELISA）测定血清睾酮、皮质酮和褪黑素水平；采用Percoll密度梯度离心法分离纯化Leydig细胞并进行实时荧光定量PCR（qRT-PCR）分析基因表达；使用TMRE和MitoTracker荧光探针分别检测线粒体膜电位（ΔΨm）和线粒体质量；通过ATP生物发光法测定细胞能量状态；对睾丸组织进行H&E和PAS染色开展组织形态计量分析；并利用计算机辅助精液分析（CASA）和考马斯亮蓝染色评估精子数量及顶体反应功能。

DD altered activity patterns and impaired blood hormone levels

研究发现，DD暴露导致大鼠活动节律紊乱，表现为活动起始点每日提前，自由运转周期缩短至23.83小时，且总活动量下降约40%。尽管体重无显著变化，但pnd 35时依赖雄激素生长的精囊腺和背侧前列腺重量显著降低，提示早期生殖发育延迟。血清学检测显示，DD组大鼠睾酮水平在成年期显著降低，而皮质酮在pnd 35时升高，导致睾酮/皮质酮（T/C）比值持续偏低。成年大鼠在五个时间点的昼夜节律监测进一步表明，DD条件下睾酮、皮质酮和褪黑素的节律性分泌均趋于平坦化，且与活动节律失调同步，表明内分环系统的时间协调性被破坏。

DD impaired Leydig cell development

基因表达分析显示，正常发育过程中，垂体促性腺激素亚基（Cga、Lhb、Fshb）及GnRH受体（Gnrhr）表达随年龄增长而上调，Leydig细胞成熟标志物胰岛素样因子3（Insl3）亦逐渐升高，而5α-还原酶1（Srd5a1）表达下降。DD条件下，促性腺激素基因在幼年和围青春期表达升高，但至成年期显著抑制，Gnrhr表达亦在成年期降低。Leydig细胞中，促黄体生成素受体（Lhcgr）及Insl3表达未受明显影响，但固醇生成关键基因出现发育阶段特异性抑制。主成分分析（PCA）表明，正常发育中固醇生成相关基因（如Scarb1、Star、Cyp17a1）在线粒体功能基因（如Cytc）和时钟基因（如Bmal1、Per2）的协同下逐步建立成熟表达模式；而DD破坏了该协调性，尤其在围青春期引起时钟基因（Clock、Bmal1、Per2等）异常上调。

DD disturbed the transcription of genes related to steroidogenesis in Leydig cells during maturation

具体而言，DD引起固醇生成通路多个关键基因表达下调：胆固醇转运蛋白Scarb1在祖细胞和成年Leydig细胞中均受抑制；线粒体胆固醇转运蛋白Star在所有发育阶段表达降低；成年期酶基因Hsd3b1/2、Cyp17a1及转录因子Sf1、Dax1表达下降。相反，抑制因子Gata4在未成熟Leydig细胞中上调。这些分子改变共同导致睾酮合成能力受损。

DD disturbed Mitochondrial Function in Leydig cells during maturation

线粒体功能分析显示，正常发育中Leydig细胞线粒体膜电位（ΔΨm）和ATP含量随年龄增加，但线粒体质量不变，提示功能提升而非数量扩增。DD条件下，尽管ΔΨm在各阶段均升高，线粒体质量却在成年期下降，ATP产量持续处于低位，呈现能量代谢解偶联。相关性分析进一步揭示，正常条件下睾酮水平与ΔΨm正相关，而DD下此关系逆转为负相关。基因表达上，DD在围青春期上调线粒体动态相关基因（融合基因Opa1、Mfn1；分裂基因Drp1）及线粒体自噬标志物Pink1，提示DD引发线粒体质量控制和重构的代偿性激活，但不足以恢复ATP合成及固醇生成效率。

DD Alters Clock Gene Expression in Leydig Cells During Maturation

昼夜节律基因表达分析发现，正常发育中核心时钟基因（Clock、Per2、Cry1、Cry2）及辅助环路基因Reverba表达至成年期逐渐上调，体现节律调控的成熟。DD则引起围青春期时钟基因（Clock、Bmal1、Per2、Reverba、Reverbb、Rorb）广泛上调，而Per1、Cry1等在幼年期受抑，表明光剥夺改变了时钟基因的发育表达动态，可能破坏其与固醇生成基因的时序协调。

DD Delays Spermatid Maturation and Impairs Sperm Function in Male Rats

精子发生评估表明，DD导致精子细胞成熟关键标志物——鱼精蛋白2（Prm2）和过渡核蛋白1（Tnp1）的表达在发育早期受抑，组织学分析进一步证实围青春期大鼠生精小管第七期伸长精子细胞数量减少，成年期睾丸内伸长精子细胞及附睾精子计数均显著下降。功能上，DD组精子孕酮诱导的顶体反应率降低，表明精子获能及受精能力受损。

综上所述，该研究通过多维度证据表明，环境光剥夺通过扰乱中枢及外周昼夜节律系统，导致下丘脑-垂体-睾丸轴激素分泌节律失常、Leydig细胞固醇生成关键基因表达抑制、线粒体能量代谢解偶联及时钟基因发育表达模式异常，最终延迟Leydig细胞成熟、降低睾酮输出并损害精子发生与功能。这不仅揭示了光环境作为关键授时因子在雄性青春期发育中的重要作用，也为理解盲人、极地居民或轮班工作者可能面临的生殖健康风险提供了实验依据，同时提示维持规律光暗周期对保障男性生育力的重要性。