鞭毛蛋白共表达增强mRNA疫苗诱导的细胞毒性T淋巴细胞反应但未显著提升抗肿瘤免疫

《Scientific Reports》：Flagellin co-expression potentiates mRNA vaccine-induced cytotoxic T lymphocyte responses but not anti-tumor immunity

本研究针对个性化新抗原mRNA疫苗在临床应用中疗效仍需提升的问题，探讨了鞭毛蛋白（FljB）作为佐剂对模型抗原卵清蛋白（OVA）mRNA疫苗的增效作用。通过对比FljB与OVA共表达（FljB-OVA mRNA）和分列表达（FljB mRNA/OVA mRNA）策略，发现共表达可显著增强脾脏中颗粒酶B（GrB）、穿孔素（perforin）和干扰素γ（IFNγ）分泌性CD8+及CD4+T细胞反应，并提高肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）中细胞毒性效应分子表达，但肿瘤内CD8+T细胞浸润反而减少，导致抗肿瘤效果未显著改善。研究为优化mRNA疫苗佐剂设计提供了新思路，并提示需联合策略促进效应T细胞肿瘤浸润。

　　

近年来，个性化新抗原mRNA疫苗在晚期黑色素瘤和胰腺癌的早期临床试验中展现出显著潜力，为癌症免疫治疗带来了新希望。然而，如何进一步提高其疗效仍是当前研究的重点。传统蛋白疫苗中广泛使用的佐剂（如鞭毛蛋白）能否适用于mRNA平台，并有效增强细胞免疫反应，成为一个值得探索的科学问题。鞭毛蛋白作为Toll样受体5（TLR5）激动剂，虽在细菌、病毒及寄生虫疫苗中显示佐剂潜力，但其在mRNA疫苗中的应用仍面临挑战：一方面，佐剂诱导的信号通路可能干扰mRNA翻译效率；另一方面，如何协调佐剂与抗原的递送方式以最大化免疫激活效果尚不明确。

为解决上述问题，罗德岛大学的研究团队在《Scientific Reports》上发表论文，系统评估了鞭毛蛋白（FljB）通过mRNA形式与模型抗原OVA共表达或分列表达对mRNA疫苗免疫效果的影响。研究采用脂质纳米颗粒（LNP）封装mRNA，通过动态光散射（DLS）和冷冻电镜（Cryo-EM）表征其物理性质，并在表达OVA的B16F10黑色素瘤模型中比较了不同免疫策略诱导的体液免疫、细胞免疫及抗肿瘤效果。关键实验技术包括：LNP-mRNA疫苗制备与表征、流式细胞术分析脾脏及肿瘤浸润淋巴细胞亚群与细胞因子分泌、酶联免疫吸附试验（ELISA）检测血清抗体与IL-6水平、以及肿瘤体积动态监测。

ΔD2D3及FljB_ΔD2D3-OVA mRNA结构示意图（信号肽未显示）。（B-C）FljB-OVA mRNA封装LNP的DLS粒径分析（B）和冷冻电镜形态（C）。标尺：100 nm。'>

FljB共表达增强Th2偏倚的IgG1抗体反应

研究发现，FljB与OVA共表达（FljB-OVA mRNA）或分列表达（FljB mRNA/OVA mRNA）均降低了总抗OVA IgG水平，但显著提高了IgG1亚型抗体滴度，同时抑制了IgG2c产生，提示FljB佐剂倾向于诱导Th2型体液免疫反应。值得注意的是，共表达策略引发的抗FljB抗体反应远强于分列表达，且分列表达组在免疫后3小时血清IL-6水平显著升高，共表达组则仅轻微上升，表明共表达模式具有更好的安全性。

FljB共表达显著增强脾脏CD8⁺与CD4⁺T细胞反应

通过流式细胞术分析脾脏T细胞发现，FljB-OVA共表达而非分列表达显著提高了GrB⁺、IFNγ⁺和穿孔素⁺CD8⁺T细胞比例，分别增加2.5倍、2.6倍和2.1倍；同时，双阳性（如GrB⁺穿孔素⁺）及三阳性（GrB⁺穿孔素⁺IFNγ⁺）CD8⁺T细胞也显著增加。类似趋势见于CD4⁺T细胞，共表达组GrB⁺、IFNγ⁺和穿孔素⁺细胞比例提升2.3–2.8倍，且双阳性细胞亚群增多，但未检测到三阳性CD4⁺T细胞。

+T细胞反应。（A-F）GrB⁺（A-B）、IFNγ⁺（C-D）及穿孔素⁺（E-F）CD8⁺T细胞比例。（G-J）双阳性及三阳性CD8⁺T细胞亚群比较。'>

FljB降低肿瘤浸润CD8⁺T淋巴细胞比例

尽管脾脏中细胞毒性T细胞反应增强，肿瘤浸润淋巴细胞（TILs）分析显示，FljB共表达或分列表达均降低了CD8⁺TILs比例，但共表达组CD8⁺/CD4⁺TILs比值显著高于分列表达组，提示共表达策略更有利于效应T细胞在肿瘤局部的富集。

+与CD8⁺TILs代表性流式图。（B-D）CD8⁺TILs比例（B）、CD4⁺TILs比例（C）及CD8⁺/CD4⁺TILs比值（D）。'>

FljB共表达提升TILs中穿孔素分泌性细胞比例

在肿瘤局部，共表达策略显著提高了穿孔素⁺CD8⁺TILs（增加45%）以及穿孔素⁺和GrB⁺CD4⁺TILs（分别增加3.5倍和4.3倍），而分列表达无此效果，说明共表达更能促进TILs的细胞毒性功能。

+TILs中穿孔素⁺（A-B）、GrB⁺（C）及IFNγ⁺（D）细胞比例。（E-G）CD4⁺TILs中相应细胞因子阳性细胞比例。'>

FljB共表达较分列表达更显著抑制肿瘤生长速率

肿瘤生长监测显示，OVA mRNA单独接种已显著抑制肿瘤生长，FljB分列表达未进一步增效，而共表达虽略优于单独OVA mRNA组，但无统计学显著性。共表达组在接种后23天时肿瘤体积显著小于分列表达组，表明共表达策略在抑制肿瘤进展方面更具优势。

结论与讨论

本研究表明，FljB与OVA通过mRNA共表达（而非分列表达）可显著增强脾脏中GrB、IFNγ和穿孔素分泌性CD8⁺及CD4⁺T细胞反应，并提高TILs的细胞毒性分子表达，证实了鞭毛蛋白作为mRNA疫苗佐剂在激活系统性细胞免疫方面的潜力。然而，共表达策略虽提升了效应T细胞质量，却未能有效促进其肿瘤浸润，导致抗肿瘤效果未显著改善。这一矛盾提示，未来需结合肿瘤微环境调控策略（如局部递送免疫刺激因子）以增强效应T细胞向肿瘤部位的募集。研究为个性化mRNA疫苗的佐剂优化提供了重要实验依据，并强调了佐剂递送方式对抗原特异性免疫反应格局的关键影响。