间充质干细胞来源小细胞外囊泡的制备方法比较及其对视网膜色素上皮氧化损伤的保护作用研究

《Scientific Reports》：Comparison of production methods for mesenchymal stem cell-derived small extracellular vesicles and evaluation of their effects on retinal pigment epithelium

本研究针对视网膜色素变性（RP）治疗中氧化应激导致视网膜色素上皮（RPE）损伤的难题，系统优化了骨髓间充质干细胞来源小细胞外囊泡（BM-MSC-sEVs）的GMP级生产流程。研究发现，切向流过滤（TFF）相较于超速离心（UC）可显著提高sEVs的产量与纯度，并证实sEVs能通过抑制凋亡和促进增殖有效缓解H2O2诱导的ARPE-19细胞损伤。该研究为sEVs作为视网膜疾病的无细胞治疗策略提供了工艺优化依据和临床前证据。

　　

视网膜色素变性（Retinitis Pigmentosa, RP）是一种全球患病率约为1/3000的遗传性视网膜疾病，其病理机制涉及光感受器细胞进行性退化及随之而来的氧化应激损伤，最终导致视网膜色素上皮（Retinal Pigment Epithelium, RPE）功能障碍。当前，间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cells, MSCs）因其免疫调节和组织修复能力，在眼科疾病治疗中展现出潜力。然而，直接使用MSCs存在引发不良反应的风险，如研究者前期临床试验中观察到轻度至重度不良事件。为解决这一问题，基于小细胞外囊泡（small Extracellular Vesicles, sEVs）的无细胞治疗策略应运而生。sEVs是直径30-150纳米的纳米颗粒，可携带蛋白质、核酸等活性物质，通过旁分泌机制调控氧化应激、抑制炎症反应，但其临床应用仍受限于制备工艺的标准化与功能验证。

本研究发表于《Scientific Reports》，旨在优化骨髓间充质干细胞来源sEVs（BM-MSC-sEVs）的GMP（Good Manufacturing Practice）级生产流程，并评估其对过氧化氢（H₂O₂）诱导的ARPE-19细胞损伤的保护作用。研究团队从5名健康捐赠者骨髓中分离BM-MSCs，在无血清培养基中扩增后，比较了超速离心（Ultracentrifugation, UC）与切向流过滤（Tangential Flow Filtration, TFF）两种方法分离sEVs的效率，并通过纳米颗粒跟踪分析（NTA）、透射电镜（TEM）和Western blot对sEVs进行表征。功能实验采用ARPE-19细胞模型，通过MTS法、流式细胞术和活细胞成像等技术，分析sEVs对细胞增殖、凋亡及H₂O₂损伤的干预效果。

主要技术方法概述

研究使用人源骨髓捐赠者（n=5）提取的BM-MSCs，在α-MEM（Alpha Minimum Essential Medium）培养基中扩增，并通过流式细胞术鉴定其表面标志物（CD73/CD90/CD105阳性，CD34/CD45/HLA-DR阴性）及三系分化能力。sEVs分离采用UC与TFF（300 kDa、500 kDa膜）对比方案，并通过NTA、TEM、Western blot（检测CD9/CD63/TSG101标志物）进行质量控制。功能实验以ARPE-19细胞为模型，通过H₂O₂诱导氧化损伤，评估sEVs的毒性、保护性（预处理）及治疗性（后处理）作用。

研究结果

1. 培养基类型对BM-MSCs增殖及sEVs分泌的影响

BM-MSCs在α-MEM与DMEM（Dulbecco's Modified Eagle Medium）中均保持成纤维细胞样形态，但α-MEM组细胞增殖倍数（1.99±0.55天）略高于DMEM组（2.25±0.46天），且sEVs产量更高（4,318.72±2,110.22颗粒/细胞）。Western blot证实两组sEVs均表达CD9、CD63、TSG101，且无内质网标志物Calnexin污染。

2. TFF显著提升sEVs产量与纯度

与UC相比，TFF-300 kDa膜分离的sEVs颗粒浓度（2.03×10¹²±0.59×10¹¹）和蛋白总量（18.74±3.90 μg）均显著更高，纯度（颗粒数/μg蛋白）达1.10×10¹¹±1.10×10¹⁰。电镜显示TFF与UC分离的sEVs均呈典型杯状结构，且无菌检测符合GMP标准。

3. sEVs被ARPE-19细胞内化并缓解氧化损伤

PKH26标记的sEVs可被ARPE-19细胞摄取，且TFF-300 kDa组内化效率最高。在H₂O₂（350 μM）诱导的损伤模型中，sEVs预处理（sEVs-H₂O₂）与后处理（H₂O₂-sEVs）均能显著提升细胞存活率（分别达54.80±3.22%与52.68±0.49%），并降低凋亡细胞比例（流式检测 Annexin V⁺/7AAD⁺细胞减少）。CFSE增殖实验进一步证实sEVs可促进ARPE-19细胞分裂（增殖率36.70±1.59%）。

4. 供体个体差异影响sEVs功能

不同供体来源的sEVs均无细胞毒性，但其对H₂O₂损伤的保护效果存在差异，其中供体1的sEVs效果最佳（存活率58.00±1.61%），提示个体遗传背景可能影响sEVs活性。

结论与意义

本研究首次系统比较了BM-MSC-sEVs的规模化制备工艺，明确TFF-300 kDa为高效、高纯度分离方案。功能实验证实sEVs可通过抑制凋亡和促进增殖，双向缓解氧化应激诱导的RPE损伤，且效果与给药时序（预防性或治疗性）无关。该研究为sEVs作为视网膜疾病的无细胞治疗提供了标准化生产路径和临床前证据，尤其为视网膜色素变性的干预策略开辟了新方向。未来需进一步解析sEVs中关键活性成分（如IL-6、VEGF、CNTF等）的作用机制，并推动其在器官芯片或视网膜类器官模型中的验证。