蛋白质磷酸化响应的全球比较结构分析揭示构象选择与变构调控新机制

《Nature Communications》：Global comparative structural analysis of responses to protein phosphorylation

本研究针对真核生物中大多数磷酸化位点功能未知的瓶颈问题，通过系统比较PDB中磷酸化与非磷酸化蛋白质结构，揭示了磷酸化通过构象选择机制诱导小幅度稳定化构象变化、调控局部残基波动并影响整体蛋白运动的规律。研究发现少数磷酸化位点与功能位点存在机械耦合，支持变构信号传导的多米诺模型，为合成生物学中理性设计磷酸化驱动调控回路奠定了结构基础。

　　

在细胞生命活动的精密调控网络中，蛋白质磷酸化作为最普遍、最关键的翻译后修饰之一，通过可逆地添加带双负电荷的磷酸基团，精准调控着蛋白质的构象、活性、定位及相互作用。尽管质谱技术的飞速发展使得人类蛋白质组中高达75%的磷酸化位点得以鉴定，但绝大多数磷酸化位点的生物学功能仍笼罩在迷雾之中，成为后基因组时代功能解析的重大挑战。更复杂的是，磷酸化不仅可以直接修饰功能位点（正交效应），更常作为变构效应物，远程调控蛋白质远端区域的功能，而这种变构通讯的分子机制至今仍知之甚少。传统的定点突变模拟磷酸化方法往往无法真实再现磷酸化的行为，而蛋白质数据库中磷酸化结构的 historically limited availability，使得从全局视角揭示磷酸化调控蛋白质结构和功能的一般规律步履维艰。

为了破解这一难题，来自欧洲生物信息学研究所、苏黎世联邦理工学院等机构的研究团队在《Nature Communications》上发表了最新研究成果。他们巧妙地利用蛋白质数据库中日益丰富的磷酸化结构及其非磷酸化对应物，首次进行了物种无关的、系统的比较结构分析，深入探究了磷酸化如何影响蛋白质的骨架构象、动力学特性和机械应变。

研究人员开发了一套结合结构生物信息学和生物物理学的三管齐下的计算分析流程。关键技术方法包括：从PDB中挖掘并严格筛选出225个独特蛋白质的347个磷酸化位点及其对应结构；利用主成分分析（PCA）和HDBSCAN聚类探索磷酸化结构域构象空间；采用集成正态模式分析（eNMA）结合原子化弹性网络模型（ENM）预测残基波动和运动模式；通过线性互信息矩阵比较评估残基-残基耦合变化；并创新性地应用蛋白质应变分析（PSA）量化局部机械变形，识别磷酸化位点与功能位点之间的机械耦合。

磷酸化与微小、稳定的构象变化相关

研究团队首先通过计算骨架均方根偏差（RMSD）来评估磷酸化引起的全局构象变化程度。结果显示，磷酸化确实与骨架构象的显著变化相关，但大多数变化幅度较小（中位RMSD为1.14 ?），仅有28.14%的磷酸化事件伴随≥2 ?的变化。更重要的是，磷酸化结构之间的中位RMSD显著小于其非磷酸化对应物，表明磷酸化倾向于使蛋白质结构更加均一，稳定了特定的构象。这种稳定化趋势与结晶条件或研究方法等批次效应无关。

进一步分析发现，预测为功能性的磷酸化位点（功能评分≥0.5）伴随的构象变化更大。不同残基磷酸化诱导的构象变化程度也存在显著差异，苏氨酸磷酸化变化最大，组氨酸最小。此外，研究证实磷酸化常产生变构效应，其诱导的构象变化往往超越磷酸化位点所在的蛋白质结构域，影响蛋白质的远端区域。

磷酸化构象是预先存在且可及的

为了探究磷酸化蛋白质所采取的构象是否为其结构景观中固有的、非磷酸化状态下即可及的状态，研究人员聚焦于Pfam结构域，检索了所有可用结构并进行低维嵌入和聚类分析。结果发现，磷酸化结构强烈倾向于存在于包含至少一个非磷酸化结构的簇中。这一现象表明，磷酸化蛋白采取的构象是预先存在的，其获取不依赖于磷酸化修饰本身，更符合构象选择模型，而非诱导契合模型。

磷酸化诱导局部残基波动变化并改变运动模式

鉴于磷酸化的变构效应及其通常引发小幅度构象变化的特性，研究团队转而关注蛋白质动力学的变化。通过集成正态模式分析，他们评估了残基波动、正态运动模式和残基-残基耦合三个方面的变化。结果显示，磷酸化与非磷酸化蛋白的残基波动谱整体高度相关，仅10.9%的案例发生整体灵活性的显著改变，且增加和减少的情况大致相当。然而，深入分析发现，82.8%的磷酸化事件伴随着至少一个局部波动差异的显著峰值，表明磷酸化频繁地改变局部热波动，但其方向（增加或减少灵活性）高度依赖于具体情境。

这些局部波动变化源于底层运动模式的改变。分析表明，即使在变化最小的子集中，磷酸化也普遍对蛋白质运动进行微调，通常通过低频（LF）运动来区分。例如，大肠杆菌延伸因子Tu 1（EF-Tu 1）磷酸化后通过限制动力学而失活，分析显示其磷酸化形式中存在明显的静态区域；而人极光激酶A（Aurora kinase A）磷酸化激活后，则表现出整体的扭转运动。

磷酸化以多样但罕见的方式改变残基-残基耦合

残基运动之间的耦合是变构合作性的基础。研究团队通过计算残基-残基互信息矩阵并比较其RV2系数发现，磷酸化与非磷酸化结构之间的预测残基耦合高度相似（87%的案例RV2系数≥0.90），表明磷酸化显著改变残基运动耦合的情况相对少见。然而，磷酸化确实可以从两个维度改变动态耦合：整体互信息的增加（紧张状态）、减少（松弛状态）或耦合模式的重排（ rewiring ）。这些改变，特别是重排，可能预示着变构信号传递方式的转变。

磷酸化位点与蛋白质功能位点的机械耦合水平较低

变构调控涉及将扰动从调控位点传递到远端功能位点。为了捕捉磷酸化可能引发的局部变形，研究采用了基于弹性理论的蛋白质应变分析（PSA）。结果显示，磷酸化位点附近的局部平均应变显著高于背景水平，而功能位点的应变则略低于背景。然而，在单个蛋白质水平上，仅27%的磷酸化位点和12%的功能位点表现出高应变，且仅有5%的磷酸化位点-功能位点对被发现是共应变的。对高应变流形的分析进一步支持了这一结论，磷酸化位点在流形中的代表性高于功能位点。

尽管如此，那些显示共应变的磷酸化位点-功能位点对，其磷酸化与蛋白质分子功能之间往往存在已知关系，特别是在ATP结合口袋中表现出显著的过度代表性，暗示在这些特定案例中存在着变构调控的机械耦合。

这项研究系统地描绘了磷酸化调控蛋白质功能的多样化机制蓝图。其核心结论在于，磷酸化主要通过构象选择而非诱导契合来稳定特定的预先存在的构象，并频繁通过改变局部动力学（熵变构）施加其调控效应。虽然大规模改变残基-残基耦合或通过机械应变直接耦合功能位点的情况相对少见，但它们确实存在，并可能在某些关键调控中扮演重要角色。该研究建立的比较结构分析框架和方法学，不仅为深入理解磷酸化功能提供了新视角，也为研究其他翻译后修饰（如乙酰化）的效应奠定了基础。更重要的是，这些发现将指导合成生物学中理性设计新型磷酸化位点和非天然PTM位点，从而助力构建由PTM驱动的复杂调控回路，解锁合成生物学中一个尚未充分探索的调控层面。尽管研究受限于PDB数据库的固有偏差（如偏向于有序区域、功能性位点），但其揭示的总体趋势和开发的分析策略，无疑将推动蛋白质磷酸化功能预测和蛋白质工程领域的进一步发展。