HIV-1整合酶寡聚体结构揭示功能可塑性：病毒内含体组装与RNA结合的新机制

《Nature Communications》：Oligomeric HIV-1 integrase structures reveal functional plasticity for intasome assembly and RNA binding

本研究针对HIV-1整合酶（IN）在病毒复制早期和晚期分别介导病毒DNA整合和病毒RNA（vRNA）结合的双重功能机制这一科学问题，通过冷冻电镜技术解析了野生型HIV-1 IN四聚体及十六聚体内含体的高分辨率结构。研究揭示了IN C-末端结构域（CTD）通过构象可塑性介导功能特异性寡聚化组装的新机制，并发现E35-K240盐桥对IN四聚化及功能的关键调控作用。该研究不仅阐明了IN在病毒复制周期中的多功能结构基础，而且为针对IN四聚体的变构抑制剂（ALLINIs）研发提供了原子水平的蓝图，对艾滋病治疗策略发展具有重要意义。

　　

在艾滋病病毒（HIV-1）漫长的复制周期中，整合酶（Integrase, IN）扮演着双重关键角色：在病毒入侵早期，IN寡聚化成"内含体"（intasome）复合物，催化病毒DNA（vDNA）整合入宿主基因组；而在病毒颗粒组装晚期，IN四聚体结合病毒RNA（vRNA），指导核糖核蛋白复合物（RNPs）有序包装进入衣壳核心。然而，介导这些截然不同功能的IN高级结构组装体一直难以解析，成为领域内数十年的科学难题。

更令人困惑的是，IN突变体表现出明显的功能多效性：一些突变（如D64、D116、E152活性位点突变）主要影响DNA整合功能（I类突变），而大多数突变（II类突变）还损害逆转录、病毒颗粒组装和释放等多个环节。这种多效性暗示IN可能通过不同的寡聚化状态执行其多功能。此外，IN四聚体正是临床研究中的变构整合酶抑制剂（ALLINIs，如处于II期临床试验的pirmitegravir）的作用靶点。然而，由于IN固有的动态特性，其天然四聚体结构和完整十六聚体内含体的原子模型始终缺失。

针对这一挑战，研究团队开展了系统性研究。他们利用冷冻电镜（cryo-EM）技术，成功解析了野生型HIV-1 IN的两种关键寡聚体结构：与LEDGF/p75整合酶结合域（IBD）复合的IN四聚体，以及完整的十六聚体HIV-1内含体结构。这些结构揭示了IN C-末端结构域（CTD）及其连接区域如何通过惊人的结构可塑性，组装成功能各异的寡聚形式。

研究采用的关键技术方法包括：利用LEDGF/p75 IBD稳定可溶性IN四聚体并进行冷冻电镜结构解析；通过交联策略稳定内含体复合物并结合聚焦分类方法解析十六聚体结构；采用尺寸排阻色谱（SEC）分析IN突变体的寡聚化状态；通过体外整合实验和AlphaScreen RNA桥接实验评估IN功能；利用病毒学实验验证IN突变体在HIV-1感染中的表型。

IN四聚体结构揭示CTD介导的架构完整性

研究人员首先通过共表达IN和IBD，获得了稳定的IN-IBD四聚体复合物。冷冻电镜结构显示，IN四聚体具有二重旋转对称性，四个IN单体通过C-末端结构域（CTD）的互锁排列维持架构完整性。所有三个功能域——N-末端结构域（NTD）、催化核心结构域（CCD）和CTD——在密度中均得到清晰解析。

结构比较发现，CTD相对于CCD二聚体支架表现出显著的位置灵活性，CCD-CTD连接区的构象可塑性是调控不同IN组装体的关键。这种可塑性使得CTD能够参与多种相互作用：包括与NTD的相互作用、与CCD-CTD连接区的相互作用，以及CTD之间的反平行相互作用。这种反平行的CTD:CTD界面在IN四聚体中首次通过冷冻电镜证实其生物学相关性，不同于此前溶液中核磁共振结构观察到的平行构象，但与ALLINI-IN组装体中的晶体堆积相互作用相似。

IN四聚体构成十六聚体HIV-1内含体的核心组织单元

通过交联稳定和计算分类策略，研究人员成功解析了完整十六聚体HIV-1内含体的结构。该结构由四个IN四聚体构成，每个四聚体通过内部互锁的CTDs将两个CCD:CCD二聚体连接在一起。与游离IN四聚体相比，内含体中的IN四聚体发生了"压缩"构象变化，两个二聚体靠得更近，同时伴随CTDs和NTDs的重排以适应vDNA的缠绕。

四聚体组装的功能意义在体外和感染细胞中得到验证

为了验证IN四聚体的功能相关性，研究人员瞄准了NTD（E35）和CTD（K240）之间新发现的盐桥相互作用。通过设计反向电荷突变（E35K、K240E）和电荷互换双突变（E35K/K240E），发现IN的体外催化活性和RNA结合能力与四聚化程度密切正相关。E35K部分损害、K240E严重损害IN四聚化和功能，而E35K/K240E双突变则能部分恢复K240E的功能缺陷。

在HIV-1病毒感染实验中，E35K和K240E均导致感染性下降，但K240E的表型更为严重（>1000倍），符合II类IN突变特征。透射电镜显示K240E病毒颗粒中偏心表型（RNPs位于衣壳外）显著增加，而E35K/K240E双突变能部分纠正这种形态缺陷。这些结果强有力地证明IN四聚化对其在病毒复制早期和晚期的双重功能都至关重要。

对IN四聚体结合vRNA的启示

IN四聚体结构为理解其vRNA结合机制提供了重要线索。四个CTDs沿两个IN二聚体界面呈锯齿状排列，形成一个横跨80?的正电荷表面，适合结合RNA。中心空腔（约40?）可容纳单链和双链RNA片段。研究人员通过定点突变证实，破坏该正电荷裂隙的残基（如K215E、K219E、K244E、R262E）均损害RNA桥接活性，而恢复四聚化的电荷互换突变（E11K/K186E）也能恢复RNA结合功能。

研究结论与意义

本研究通过解析HIV-1 IN四聚体和十六聚体内含体的高分辨率结构，揭示了IN通过结构可塑性介导其多功能性的分子基础。研究证实IN四聚体是病毒复制早期和晚期的关键功能单元，其稳定性由E35-K240盐桥等界面相互作用维持。这些发现不仅深化了对HIV-1复制机制的理解，而且为针对IN四聚体的变构抑制剂设计提供了精确的原子蓝图，对开发新型艾滋病治疗策略具有重要指导意义。

该研究的局限性在于结构基于重组组分组装，而非直接来自感染细胞。然而，通过巧妙的遗传学验证，强有力地支持了所发现结构的生物学相关性。未来研究可进一步探索IN寡聚体在细胞内的动态变化及其与宿主因子的相互作用，为全面理解HIV-1复制机制提供更完整的图景。