人胚胎间充质干细胞中EWS::FLI1表达诱导尤文肉瘤发生的新机制——转录重编程与DNA损伤修复缺陷的作用

《Nature Communications》：EWS::FLI1 expression in human embryonic mesenchymal stem cells leads to transcriptional reprograming, defective DNA damage repair and Ewing sarcoma

本研究针对尤文肉瘤(ES)细胞起源不明的关键科学问题，通过在人胚胎间充质干细胞(heMSCs)中表达EWS::FLI1融合癌蛋白，发现其通过结合内含子微卫星区域诱导ES特异性转录组，直接调控BRCA1表达导致DNA损伤修复(DDR)缺陷，并首次在体内成功构建ES肿瘤模型。这项发表于《Nature Communications》的研究为发育性肿瘤的起源研究提供了创新方法。

　　

尤文肉瘤(Ewing sarcoma, ES)是一种好发于青少年和年轻人的高度恶性骨与软组织肿瘤，其典型特征是EWSR1/ETS基因易位，其中EWS::FLI1融合基因最为常见。尽管该融合基因被认为是ES的主要驱动因素，但关于哪些细胞能够被其转化以及转化的具体机制，至今仍是未解之谜。尤其令人困惑的是，当在成体间充质干细胞中表达EWS::FLI1时，虽然能诱导部分ES相关基因表达，却无法形成肿瘤，这提示ES可能起源于更早期的胚胎干细胞。

为了解决这一难题，研究人员将目光投向了人胚胎间充质干细胞(human embryonic mesenchymal stem cells, heMSCs)。这些细胞来源于人胚胎干细胞形成的实验性畸胎瘤，具有更原始的干细胞特性。与成人间充质干细胞相比，heMSCs的线粒体呈现碎片化分布，代谢特征更接近多能干细胞，为研究EWS::FLI1在早期发育阶段的作用提供了理想模型。

研究人员首先从实验性畸胎瘤中分离鉴定heMSCs，确认其符合间充质干细胞的标准特征。随后，通过慢病毒转导在heMSCs中表达Flag标记的EWS::FLI1，发现即使表达水平低于ES细胞系A673，也足以诱导显著的转录组改变。RNA测序分析显示，3836个基因表达发生显著变化，其中上调基因主要富集于G蛋白偶联受体信号通路和循环系统相关生物学过程。

尤为重要的是，EWS::FLI1在heMSCs中诱导的转录谱与人类ES高度相似。基因集富集分析证实，EF-heMSCs的转录组在ES特征基因中显著富集，且这一特征依赖于EWS::FLI1的表达水平。通过比较不同细胞系统中EWS::FLI1诱导的转录特征，研究人员发现heMSCs模型最能重现ES的转录组特征。

为了探究EWS::FLI1如何重塑转录组，研究人员进行了染色质免疫沉淀测序(ChIP-seq)分析。出乎意料的是，在heMSCs中，EWS::FLI1主要结合于基因间区和内含子区域，而非传统的启动子区域。 motif分析进一步揭示，在基因间区，EWS::FLI1偏好结合GGAA重复序列，而在内含子和启动子区域，则主要结合串联的CA二核苷酸重复序列(≥10次)。与ES细胞系A673相比，EWS::FLI1在heMSCs中的结合位点重叠度很低，提示其在肿瘤发生过程中可能经历染色质重编程。

研究还发现，EWS::FLI1直接结合BRCA1基因的第11和15外显子，上调其表达。然而，尽管BRCA1水平升高，EF-heMSCs却表现出DNA损伤修复缺陷。碱性彗星实验证实这些细胞存在基线DNA损伤，且对依托泊苷等DNA损伤药物更为敏感。机制上，EWS::FLI1表达导致ATM和ATR磷酸化缺陷，影响BRCA1的正常功能。

最令人振奋的是，将EWS::FLI1转导的heMSCs移植到NOD/SCID小鼠体内后，约40%的小鼠在5个月左右出现了肿瘤。这些肿瘤在组织学上表现出ES的典型特征：小圆细胞形态、活跃的增殖活性以及转移能力。通过空间转录组学分析，研究人员证实实验性肿瘤表达BCL11B、ITM2A等ES特异性标志物，且其转录组与人类ES高度相似。

本研究主要采用了以下关键技术：从人胚胎干细胞衍生的畸胎瘤中分离heMSCs；通过慢病毒转导在heMSCs中表达EWS::FLI1；利用RNA测序和ChIP-seq分析转录组和DNA结合特征；采用碱性彗星实验和Western blot评估DNA损伤修复功能；通过小鼠异种移植模型验证体内致瘤性；运用空间转录组学(10X Genomics Visium平台)分析肿瘤转录特征。

Characterization of human embryonic mesenchymal stem cells(heMSCs)

研究人员首先从人胚胎干细胞形成的实验性畸胎瘤中分离出heMSCs。这些细胞表现出典型的成纤维细胞形态，表达CD73、CD105、CD90等间充质干细胞表面标志物，并具有向成骨、成软骨和成脂分化的能力。与儿科骨髓来源的间充质干细胞(hpMSCs)相比，heMSCs的线粒体呈现碎片化分布，UCP2表达水平更高，三羧酸循环中间代谢物水平增强，反映了其更原始的 progenitor 状态。

EWS::FLI1 expression in heMSCs induces an ES transcriptional profile

在heMSCs中表达EWS::FLI1后，研究人员观察到显著的转录组改变。RNA测序鉴定出3836个差异表达基因，其中上调基因主要富集于G蛋白偶联受体信号通路和循环系统相关过程。重要的是，EF-heMSCs的转录组在ES特征基因中显著富集，且这一特征与EWS::FLI1在其他细胞系统中诱导的转录特征高度一致。

EWS::FLII binds to repetitive genomic regions in heMSCs

ChIP-seq分析显示，EWS::FLI1在heMSCs中主要结合于基因间区和内含子区域，而非传统的启动子区域。 motif分析发现，在基因间区偏好结合GGAA重复序列，而在内含子区域则主要结合CA二核苷酸重复序列。与ES细胞系A673相比，EWS::FLI1在heMSCs中的结合位点仅有部分重叠，提示其在肿瘤发生过程中经历了染色质重编程。

EWS::FLI1 induces BRCA1 expression and impairs DNA damage response

研究发现EWS::FLI1直接结合BRCA1基因的外显子区域，上调其表达。然而，尽管BRCA1水平升高，EF-heMSCs却表现出DNA损伤修复缺陷。这些细胞对DNA损伤药物更为敏感，机制上与ATM/ATR信号通路的磷酸化缺陷有关。

EF-heMSCs form Ewing-like tumors in vivo

将EWS::FLI1转导的heMSCs移植到小鼠体内后，成功诱导出具有ES典型特征的肿瘤。这些肿瘤表达ES特异性标志物，并能发生远处转移。空间转录组学分析证实实验性肿瘤的转录组与人类ES高度相似。

Experimental Ewing tumor transcriptome resembles Ewing sarcoma

通过空间转录组学分析，研究人员发现实验性肿瘤表达BCL11B、ITM2A等ES特异性标志物，且其转录特征与人类ES高度一致。这进一步验证了heMSCs作为ES细胞起源模型的可靠性。

本研究首次证实人胚胎间充质干细胞是尤文肉瘤的细胞起源。EWS::FLI1在这些早期 progenitor 细胞中通过结合内含子微卫星区域，诱导ES特异性转录组，直接调控BRCA1表达导致DNA损伤修复缺陷，最终导致肿瘤发生。这一发现不仅解决了ES细胞起源这一长期争议问题，还为理解发育性肿瘤的发生机制提供了新视角。研究人员提出的二阶段肿瘤发生模型——宫内EWS::FLI1表达引发初始事件，青春期激素水平升高促进肿瘤转化——为ES的预防和早期干预提供了理论依据。该研究建立的实验方法为研究其他发育性肿瘤的生物学特性提供了重要平台。