细胞内Apafl形成大型瞬时组装体构成凋亡体的新发现

《Nature Communications》：Large transient assemblies of Apaf1 constitute the apoptosome in cells

本研究针对凋亡体在细胞内的组装机制和形态学特征不明确的问题，通过活细胞成像、相关光镜电镜联用等技术，揭示了在凋亡信号刺激下，Apafl分子通过特异性结合细胞色素c，依赖caspase-9，在细胞质中形成多个瞬时性、云状无规则结构的“Apafl foci”，该结构即为细胞内的凋亡体，其动态的时空组织调控了细胞凋亡的进程，为理解细胞死亡调控提供了新视角。

　　

在生命体中，细胞凋亡（一种程序性细胞死亡）是维持组织稳态和清除异常细胞（如癌细胞）的关键过程。其中，线粒体凋亡通路是核心路径之一。当细胞接收到凋亡信号时，Bcl-2蛋白家族成员Bax和Bak会在线粒体外膜上寡聚化，导致膜通透性增加，使得细胞色素c（cytochrome c, cyt c）等分子从线粒体膜间隙释放到细胞质中。胞质中的cyt c会与凋亡蛋白酶激活因子1（Apoptotic protease-activating factor 1, Apafl）结合，触发Apafl构象变化，使其通过核苷酸结合寡聚化结构域（NOD）寡聚化，形成称为凋亡体（apoptosome）的复合物。该复合物进而招募并激活起始 caspase——procaspase-9，使其自我切割形成有活性的caspase-9，从而启动caspase级联反应，最终导致细胞解体。尽管通过生物化学和结构生物学方法，科学家们已经在体外成功解析了凋亡体（通常呈现为七聚体的轮状结构）的精细结构及其激活caspase-9的机制，但关于这一关键复合物在活细胞内的真实组装过程、时空动态以及其微观形态，长期以来一直是个谜。细胞内的环境远比体外复杂，凋亡体是如何在拥挤的细胞质中形成的？它的出现与细胞命运的最终决定（死亡或存活）有何关联？这些问题的解答对于深入理解细胞凋亡的调控机制至关重要。

为了揭示凋亡体在细胞内的真实面貌，研究人员在《Nature Communications》上发表了他们的研究成果。他们通过一系列精巧的实验设计，首次在活细胞中直观地捕捉到了凋亡体的动态形成过程，并揭示了其独特的结构和功能特性。

本研究主要运用了以下关键技术方法：构建稳定表达Apafl-GFP（绿色荧光蛋白）的HeLa细胞系，利用活细胞荧光成像技术实时追踪Apafl在凋亡诱导后的动态；通过免疫荧光验证内源性Apafl的行为；采用相关光镜与电子显微镜技术，包括树脂包埋样本的室温CLEM和玻璃化冷冻样本的冷冻电子断层扫描技术，在高分辨率下解析Apafl foci的三维超微结构；利用基因敲除细胞系（如Bax/Bak双敲除、caspase-9敲除）和点突变/截短体构建（如Apafl-dead-GFP, Apafl-ΔWD40-GFP），结合细胞微注射外源cyt c等手段，探究Apafl foci形成的分子机制和依赖性。

Apafl在凋亡过程中积累到细胞质焦点中

研究人员首先构建了稳定表达Apafl-GFP的HeLa细胞系，并使用Bcl-2抑制剂ABT-737诱导凋亡，通过活细胞荧光显微镜进行观察。他们发现，在凋亡发生前，Apafl-GFP均匀分布在细胞质中。随着凋亡的进行，Apafl-GFP信号会逐渐积累，形成数十个分布在细胞质中的焦点。线粒体也同时发生了碎片化，这是线粒体凋亡的典型特征。

定量分析显示，在诱导凋亡后18小时内，约有65%的细胞出现了Apafl-GFP foci。绝大多数形成foci的细胞最终会发生收缩（约92%），这是细胞死亡的标志。有趣的是，在一小部分细胞中，foci形成后并未立即导致细胞死亡，而是发生了foci的解体，随后细胞存活下来。约有22%的形成foci的细胞观察到了foci的解体现象。此外，存活细胞中单位面积的foci数量少于死亡细胞，表明foci的密度与细胞死亡的概率相关。为了更深入地研究foci的瞬时性，研究人员在诱导凋亡的同时加入了广谱caspase抑制剂QVD，以促进细胞存活，便于观察凋亡的早期事件。在这种条件下，仍有41%的细胞形成foci，但其中83%的细胞其foci会在约2小时后解体。甚至有9%的细胞在foci解体会后，会再次出现foci的形成。这些结果清晰地表明，Apafl foci是高度瞬时的结构，其解体与细胞存活密切相关。通过免疫荧光实验，研究人员进一步证实内源性的、未带标签的Apafl蛋白在凋亡诱导下同样会形成多个明亮的foci，其动力学特征与Apafl-GFP相似，说明Apafl foci的形成是HeLa细胞凋亡过程中固有的特征，而非荧光标签引入的假象。

Apafl foci由云状无规则形状的组装体构成

既然体外的Apafl会寡聚成轮状的七聚体凋亡体复合物，那么细胞内的Apafl foci是否就是这些凋亡体复合物的簇集体呢？为了回答这个问题，研究人员采用了相关光镜和电子显微镜技术来观察Apafl-GFP foci的三维结构。

通过对树脂包埋的细胞进行CLEM分析，他们在对应于Apafl-GFP foci的区域观察到了云状、不规则的网状结构。这种网状结构由密度不一的区域组成，内部松散地关联，并与核糖体等胞质成分交织在一起。虽然高密度区域的大小和形状各异，但网状结构在每个断层扫描体积内呈现连续性。为了排除树脂包埋可能带来的干扰，研究人员进一步采用了更接近天然状态的冷冻电子断层扫描技术。他们通过两种不同的冷冻CLEM方法，分别靶向表达Apafl-GFP或Apafl-SNAP的HeLa细胞中的Apafl foci。在获得的冷冻ET数据中，他们观察到了与树脂包埋样本中相似的结构：与Apafl foci相关的云状、连续的网状结构，其整体形状不规则，边缘不平整，呈现出致密、相互连接的大分子组装体特征。重要的是，在这些组装体中，研究人员并未识别出离散的、 indicative of a gathering of individual apoptosome wheels（指示单个凋亡体轮状结构聚集）的结构。这些CLEM数据共同表明，Apafl foci是由具有多形性超微结构的高阶组装体构成。

Apafl foci的形成依赖于Bax/Bak活性

尽管Apafl foci的结构不像离散的蛋白质复合物，但它们可能在功能上等同于凋亡体。为了验证这一假设，研究人员探究了Apafl foci的形成是否与凋亡体具有相似的机制。已知凋亡体的形成需要cyt c与Apafl的结合，而cyt c从线粒体的释放又依赖于Bax或Bak对线粒体外膜的透化作用。研究人员在Bax/Bak双敲除的HCT116细胞系和野生型HCT116细胞中表达了Apafl-GFP。他们发现，在缺乏Bax和Bak的情况下，几乎没有任何细胞显示Apafl-GFP foci的形成，而野生型细胞中则有38%的细胞形成foci。这表明Apafl foci的形成严格依赖于Bax/Bak的活性。

Bax/Bak的活性包括早期在线粒体外膜上积累并穿孔以释放cyt c，以及后期在细胞质中形成大的Bax簇。为了评估哪个阶段与Apafl foci组装相关，研究人员在Apafl-GFP HeLa细胞中过表达了RFP-Bax。Bax过表达能直接诱导凋亡，并可用来研究Bax簇的形成。他们发现，在转染RFP-Bax后，有47%的细胞形成了Apafl-GFP foci。值得注意的是，Apafl-GFP foci的出现时间比可检测到的RFP-Bax簇的形成平均早1小时45分钟。在QVD处理下，大多数Apafl-GFP foci会在此时间框架内解体，通常是在RFP-Bax簇可被检测到之前。在极少数Apafl foci和Bax簇同时存在于一个细胞的情况下，两者的信号并不共定位。这些结果表明，Apafl foci的形成和Bax簇的形成在时间和空间上是分离的事件。Apafl foci的形成依赖于Bax的早期活性，并且先于胞质Bax簇的形成。

Apafl foci通过与细胞色素c的特异性相互作用形成

研究人员接下来直接评估Apafl foci是否由cyt c的释放所诱导。他们向表达Apafl-GFP并经QVD处理的HeLa细胞中显微注射了牛源cyt c，但并未诱导凋亡。作为对照，只注射荧光葡聚糖。结果发现，cyt c显微注射能促使35%的被注射细胞形成Apafl foci，而只注射葡聚糖的细胞则未观察到foci形成。这些foci同样是瞬时的。这表明，胞质中cyt c的可用性足以触发Apafl foci的形成。

已知在体外，cyt c与Apafl的WD40重复区域结合是凋亡体形成的关键步骤。为了探究细胞中Apafl foci形成的分子相互作用，研究人员构建了一个预计无法结合cyt c的Apafl突变体，称为Apafl-dead-GFP。他们突变了WD40重复区中对cyt c结合至关重要的两个色氨酸残基。实验发现，只有5%表达Apafl-dead-GFP的细胞在ABT-737处理后形成了foci，而表达野生型Apafl-GFP的细胞则有35%形成foci。这表明，cyt c与Apafl-WD40重复区之间的特异性界面对于foci的形成至关重要。此外，研究人员还表达了一个已知在体外无需cyt c即可形成凋亡体并激活caspase-9的组成型活性Apafl突变体——Apafl-ΔWD40（缺失整个WD40重复区）。如果Apafl foci的形成机制与凋亡体相似，那么Apafl-ΔWD40-GFP应该在表达后立即形成foci，而无需cyt c或凋亡诱导。实验结果证实了这一点：59%转染Apafl-ΔWD40-GFP的HeLa细胞在胞质中检测到GFP荧光后的45分钟内就形成了foci，而在没有凋亡诱导的情况下，表达全长Apafl-GFP的细胞则没有形成foci。这表明，缺失WD40重复区能在没有凋亡刺激的情况下促进Apafl foci的形成，并且对于foci组装而言，包含CARD和NOD结构域的Apafl N端部分是足够的。结合cyt c显微注射和Apafl-dead-GFP突变体的实验结果，这些数据表明Apafl foci的形成所依赖的分子相互作用与体外凋亡体复合物的形成相似。

Caspase-9是Apafl foci形成所必需的并积累于foci中

一个引人入胜的发现是，大多数由Apafl-ΔWD40-GFP在无凋亡刺激下形成的foci也是瞬时的，平均寿命约为1小时。这意味着，尽管Apafl-ΔWD40-GFP在foci形成方面是自发活化的，但这种活性是短暂的。此外，表达Apafl-ΔWD40-GFP并形成foci的细胞，即使在没有QVD的情况下，也极少进展到细胞死亡。而当用ABT-737诱导凋亡时，有31%带有Apafl-ΔWD40-GFP foci的细胞死亡，这可能与这些细胞中存在内源性Apafl有关。相比之下，大多数表达全长Apafl-GFP并形成foci的细胞在凋亡诱导下会死亡。这些结果表明，Apafl-ΔWD40-GFP的组成型foci形成并不促进细胞死亡。

在凋亡体复合物中，procaspase-9通过CARD-CARD相互作用与Apafl结合。鉴于仅包含N端NOD和CARD结构域的Apafl-ΔWD40-GFP能够形成foci，研究人员想知道caspase-9是否在Apafl foci的形成中发挥作用。他们在HCT116野生型和caspase-9敲除细胞中表达全长Apafl-GFP，并用ABT-737诱导凋亡。结果发现，caspase-9敲除细胞中只有4%显示出Apafl-GFP foci，而野生型细胞中这一比例为36%。接下来，他们在HeLa caspase-9敲除细胞中分别表达Apafl-ΔWD40-GFP和全长Apafl-GFP（后者用ABT-737处理）。在这两种情况下，转染的细胞均未形成foci。因此，在缺乏caspase-9的情况下，无论是Apafl-ΔWD40-GFP还是全长Apafl-GFP的foci形成均受到损害。这些结果表明，Apafl foci的形成依赖于caspase-9，并且这种依赖性涉及Apafl的N端部分（包含CARD结构域）。

既然caspase-9是foci形成所必需的，那么foci中是否含有caspase-9呢？研究人员在HeLa caspase-9敲除细胞中共同表达了3xFLAG标记的caspase-9构建体和Apafl-SNAP，并用ABT-737和QVD处理。通过免疫荧光，他们发现caspase-9与Apafl foci共定位。在野生型HeLa细胞中也观察到了3xFLAG-caspase-9与Apafl-SNAP的共定位。这些结果证明，foci中同时包含了Apafl和caspase-9这两个主要的凋亡体组分，进一步证实了Apafl foci是凋亡体在细胞内的存在形式。

总结与讨论

这项研究颠覆了以往基于体外研究对凋亡体形成的认知。研究人员发现，在细胞内部，凋亡体的形成并非简单地组装成规整的轮状七聚体，而是表现为Apafl分子在细胞质中聚集形成多个大小接近细胞器的、云状网状结构的“foci”。这种结构的形成依赖于Apafl与cyt c的特异性相互作用，以及caspase-9的参与，其分子基础与已知的凋亡体组装机制一致。然而，其宏观形态却更类似于无膜细胞器或生物分子凝聚体。

Apafl foci最重要的特征之一是其瞬时性。研究清楚地表明，foci的解体与细胞存活密切相关。这提示，这种动态的组装-解组装过程可能是细胞在启动凋亡程序后仍有机会“反悔”或“中止”程序的一种调控机制。此前有模型认为，胞质中procaspase-9的量限制着caspase-9的活性时间窗口，当procaspase-9被耗尽而效应caspase的激活未达到阈值时，凋亡可能无法完成。本研究对Apafl foci动态的观察支持了这一“分子计时器”模型。foci的形成需要caspase-9，而foci内也确实富集了caspase-9