化学酶法精准合成中长链甘油三酯区域异构体及其结构解析

《FOOD SCIENCE AND BIOTECHNOLOGY》：Chemoenzymatic synthesis and identification of medium- and long-chain triacylglycerol congeners

本研究针对功能性脂质开发中脂肪酸位置特异性调控的难题，提出了一种结合脂肪酶区域选择性催化与Steglich酯化的化学酶法策略，成功合成了四种中长链甘油三酯（MLCT）区域异构体（CCL、CLC、LLC、LCL），产物纯度＞98%。通过HPLC-ESI-MS和13C NMR技术验证了分子结构与对称性，为MLCT在临床营养与功能食品中的精准应用提供了合成与表征方法学支撑。

　　

在追求精准营养的时代，甘油三酯（TAG）分子中脂肪酸的排列方式深刻影响着其代谢路径与生理功能。中长链甘油三酯（MLCT）作为一类结构化脂质（SLs），同时兼具中链脂肪酸（MCFA，如C8:0）的快速供能特性与长链脂肪酸（LCFA，如C18:2）的必需营养功能，在婴儿配方、临床营养和运动食品领域展现出巨大潜力。然而，人体胰腺脂肪酶对sn-1,3位酯键的特异性水解使得脂肪酸在甘油骨架上的位置分布成为决定MLCT代谢命运的关键。传统化学合成法缺乏位置选择性，而纯酶法又面临效率低、副反应多等局限。如何高效、精准地合成特定区域异构体的MLCT，并实现其结构验证，成为功能脂质开发的核心挑战。

针对这一难题，首尔国立大学的Pahn-Shick Chang团队在《FOOD SCIENCE AND BIOTECHNOLOGY》发表研究，开发了一种化学酶法联合策略，成功合成了四种MLCT区域异构体（CCL、CLC、LLC、LCL），并通过多维分析技术明确了其结构完整性。该研究为MLCT的精准设计与应用提供了方法学范本。

研究关键技术方法包括：首先利用固定化脂肪酶（Lipozyme 435）催化合成前体单酰基甘油（MAG），其中2-sn-MAG通过sn-1,3特异性乙醇解获得，1-rac-MAG通过异丙叉甘油保护-去保护策略制备；随后通过Steglich酯化将MAG与游离脂肪酸（癸酸C8:0或亚油酸C18:2）耦合为目标MLCT；最后结合制备型高效液相色谱（HPLC）纯化（纯度＞98%），并通过高效液相色谱-电喷雾电离质谱（HPLC-ESI-MS）和碳13核磁共振（¹³C NMR）进行结构确证。

Chemoenzymatic synthesis of MLCTs

研究通过化学酶法成功合成了两种不对称MLCT（CCL、LLC）和两种对称MLCT（CLC、LCL）。合成路径显示，对称MLCT（CLC、LCL）的产率（71-84%）显著高于不对称MLCT（52-67%），这源于对称分子酰化过程中的空间位阻更小、反应均一性更高。溶解度测试发现，含两条亚油酸的MLCT（LLC、LCL）在乙腈中溶解度较低，而含两条癸酸的MLCT（CCL、CLC）溶解度更高，反映了脂肪酸链长对极性的影响。

Purification of MLCTs

通过制备型HPLC，研究实现了四种MLCT的高效分离纯化（纯度＞98%）。CCL/CLC在乙腈/异丙醇/乙酸（90:10:0.1, v/v/v）流动相中于51分钟附近出峰，而LLC/LCL在乙腈/异丙醇/乙酸（50:50:0.1, v/v/v）条件下于24分钟出峰，收集窗口内无杂质峰干扰，表明目标产物被高效分离。纯化后的MLCT在25°C下均为液态，便于后续应用。

Structural analysis of MLCTs

HPLC-ESI-MS分析确认了MLCT的分子量：CCL和CLC的[M+NH₄]⁺加合物m/z为624.6，LLC和LCL为760.6，与理论值一致。¹³C NMR进一步区分了区域异构体：不对称TAG（CCL、LLC）显示三个羰基信号（如CCL在173.30、173.26、172.88 ppm），而对称TAG（CLC、LCL）仅显示两个信号（如CLC在173.29、172.84 ppm），证实了脂肪酸位置分布的差异性。

本研究通过化学酶法联合策略实现了MLCT区域异构体的精准合成与结构验证，突破了传统方法在位置控制与效率上的局限。研究不仅揭示了对称结构与不对称结构MLCT在合成效率与物化性质上的差异，还建立了基于¹³C NMR羰基信号数的快速区分方法。该工作为开发具有定制化代谢特性的功能脂质（如sn-2位富集必需脂肪酸的婴儿配方油）提供了关键技术支撑，推动了结构化脂质在精准营养领域的应用创新。未来研究可聚焦于MLCT异构体的体内代谢差异评估及工业化放大工艺优化。