纳米抗体抑制状态下人胆汁盐转运蛋白NTCP的高分辨率结构揭示其非活性构象机制

《Structure》：Structure of nanobody-inhibited state of human bile salt transporter NTCP

本刊推荐：为阐明钠-牛磺胆酸共转运多肽(NTCP)的构象变化机制，研究者通过冷冻电镜解析了NTCP与纳米抗体复合物的3.1?结构，结合微秒级分子动力学模拟，发现闭合隧道构象代表非活性状态而非转运必需中间态，为理解胆汁盐转运及病毒入侵机制提供新视角。

　　

在肝脏生理和病毒感染的舞台上，钠-牛磺胆酸共转运多肽(NTCP)扮演着双重关键角色：一方面作为肝细胞基底膜上负责胆汁盐摄取的关键转运蛋白，维持着肠肝循环的平衡；另一方面又是乙型肝炎病毒(HBV)和丁型肝炎病毒(HDV)入侵肝细胞的分子门户。尽管其生理和病理意义重大，但关于NTCP如何协调钠离子与胆汁盐的协同转运，以及病毒如何利用这一转运蛋白实现感染，仍存在诸多未解之谜。

近年来，NTCP的结构生物学研究取得了突破性进展。2022年，多个研究团队首次报道了NTCP的冷冻电镜结构，揭示了底物结合位点和钠离子结合位点的空间排列。然而，关于NTCP转运机制的两个对立假说始终悬而未决：一种观点认为NTCP在转运循环中经历包括闭合隧道构象在内的多个构象状态；另一种观点则认为仅需开放隧道构象即可完成主动转运，隧道内的两个胆汁盐分子可防止离子泄漏。这一争议的核心在于对NTCP闭合隧道构象功能意义的理解存在分歧。

为解决这一基础性问题，瑞士苏黎世联邦理工学院Kaspar P. Locher团队与美国伊利诺伊大学厄巴纳-香槟分校Emad Tajkhorshid团队合作，在《Structure》杂志上发表了最新研究成果。研究者从羊驼中筛选出一种能够特异性抑制NTCP功能的纳米抗体NTCP_Nb1，并利用冷冻电镜技术解析了NTCP与纳米抗体复合物的高分辨率结构，分辨率达到3.1?。这一结构揭示了NTCP的一种闭合隧道构象，该构象具有两个结合的钠离子但缺乏底物结合能力。

研究采用的关键技术方法包括：通过羊驼免疫和噬菌体展示技术筛选NTCP特异性纳米抗体；利用冷冻电镜单颗粒分析解析NTCP-纳米抗体-Fab三元复合物结构（分辨率3.1?）；通过分子动力学模拟（累计模拟时间超过24微秒）分析不同构象状态的动态特性；采用纳米盘重构技术维持膜蛋白天然脂质环境；使用酶联免疫吸附测定和细胞摄取实验验证纳米抗体的结合亲和力与抑制功能。

整体构象与面板结构域在隧道闭合中的作用

研究人员发现，NTCP_Nb1G结合在NTCP的胞外表面，覆盖867?2的表面积，涉及N末端附近残基和所有胞外环(ECL1-ECL4)。与底物结合的开放隧道构象(PDB ID: 7ZYI)相比，核心结构域保持高度相似性(RMSD=0.80?)，但面板结构域(TM1、TM5、TM6)发生刚性位移，向核心结构域靠拢，导致底物转运隧道在胞外侧关闭。TM8b向面板结构域的小幅移动也促进了隧道的闭合。特别值得注意的是，TM5的胞外端部分解旋约两个螺旋圈，延长了ECL2的长度，而ECL3在闭合构象中形成短螺旋，这与开放构象中的伸展状态形成鲜明对比。

闭合与开放隧道NTCP中钠结合位点的比较

新结构在TM3和TM8的交叉区域揭示了两个钠离子结合位点：Na1位点由S105、N106、S119和T123的侧链和骨架羰基氧原子配位，与开放隧道状态中的Na1位点完全相同；Na2b位点则由Q68、T258、G259、C260和Q261残基配位。有趣的是，在之前的开放隧道结构中，Na2b位点被水分子占据，而另一个称为Na2a的位点（距离胞外侧约4.9?）被建模为第二个钠离子结合位点。研究者推测Na1、Na2a和Na2b这三个潜在结合位点可能在转运循环中依次被钠离子占据，与面板结构域的构象变化相耦合，促进主动转运过程。

闭合与开放NTCP状态的分子动力学模拟

为探究NTCP的动态特性和转运机制，研究团队进行了微秒级分子动力学模拟。闭合隧道构象表现出极高的整体稳定性，蛋白骨架平均RMSD小于2?，两个钠离子稳定结合在初始位置。模拟过程中观察到胆固醇或细胞质叶的疏水酰基链插入隧道的脂质暴露入口区域，可能稳定隧道内的暴露疏水残基。

开放隧道构象的模拟同样显示蛋白骨架的高稳定性，但钠离子和结合的底物(GCDC)分子波动较大。Na2a位点的钠离子波动范围为1-5?，而Na1位点的钠离子动态性更强(RMSD值2-9?)。在一个模拟重复中，Na1位点的钠离子完全离开转运蛋白，通过底物转运隧道到达胞外空间。GCDC分子表现出显著的波动（RMSD值高达9?），但未完全扩散出隧道。

当从开放隧道构象中移除底物分子后，转运蛋白并未在模拟时间尺度内转换为闭合隧道构象。相反，底物结合口袋被脂质的疏水酰基链或胆固醇的甾醇核心占据，可能有助于维持开放隧道构象。钠离子位置出现强烈波动，其中一个重复中Na1位点的钠离子在200纳秒内离开转运蛋白，剩余的钠离子随后占据Na2b结合位点。

相互作用指纹分析

为补充RMSD分析，研究者使用ProLIF量化了残基-配体接触。分析显示，带负电荷的胆汁盐羧酸根基团与碱性残基K20和R21之间形成瞬时相互作用，这些相互作用在原始冷冻电镜结构中未观察到。这种配体重定位与先前观察到的较高RMSD直接相关，特别是对于Sout底物。这些结果表明配体的大幅波动伴随着蛋白质-配体相互作用模式的改变。

机制意义

结合结构和计算结果表明，闭合隧道构象可能不代表生产性胆汁盐转运循环中的必需或强制性步骤。这一结论基于两个关键观察：首先，即使存在高浓度的NTCP-Fab12结合于NTCP外表面，转运过程仍能进行。如果内向闭合隧道构象是转运循环的必需步骤，NTCP-Fab12应会抑制胆汁盐转运。其次，从无底物结合的开放隧道构象开始的分子动力学模拟未在模拟时间尺度内导致隧道闭合，表明只要存在脂质或胆固醇（或胆汁盐）填充隧道，开放隧道构象就会持续存在。

研究者提出了NTCP的构象状态模型：从非活性构象（本研究的新结构）开始，活性底物转运需要TM1、TM5、TM6和TM8b的重排以形成开放隧道。NTCP_Nb1通过钳制NTCP的外表面，阻碍了面板结构域的必要构象变化，从而抑制底物接入。在体内，必要的构象变化可能由胆汁盐招募到结合口袋所触发。

与广泛接受的 elevator 机制不同，NTCP（及其密切相关的人ASBT蛋白）仅包含9个跨膜螺旋，而该转运蛋白家族的其他成员包括原核生物SLC10同源物则含有10个螺旋。第十个螺旋对于产生屏蔽脂质膜的转运通路至关重要。在NTCP中，底物仅通过跨越质膜外叶的隧道，但随着隧道在膜中心结束，底物可自由进入内叶。这种结构特点导致NTCP无法形成封闭底物结合口袋的构象，这可能解释了NTCP对不同胆汁盐和胆汁盐类似物的多特异性。

该研究通过高分辨率结构生物学和计算模拟的有机结合，不仅揭示了NTCP的一种新的功能状态，更重要的是为理解这类重要转运蛋白的工作机制提供了新的视角。对NTCP构象动态的深入理解将为开发针对胆汁盐相关代谢疾病和病毒性肝炎的新型治疗策略奠定坚实基础。