致癌性Ras在许可体细胞中激活触发快速发生的表型可塑性并引发肿瘤促进性中性粒细胞反应

《Cell Reports》：Oncogenic Ras activation in permissive somatic cells triggers rapid-onset phenotypic plasticity and elicits a tumor-promoting neutrophil response

本刊推荐：为解析致癌突变为何在正常组织中普遍存在却很少引发肿瘤这一难题，研究人员利用斑马鱼模型开展HRASG12V诱导肿瘤起始的单细胞转录组与活体成像研究。发现基底角质形成细胞在Ras激活24小时内即可解锁表型可塑性，产生具有pEMT和CSC特征的亚群，并主动招募编程为免疫抑制表型的中性粒细胞，后者反馈促进PNC增殖。该研究首次揭示肿瘤恶性特征与促瘤炎症可在癌基因激活后同步快速涌现。

　　

在人类正常组织中，致癌基因突变其实相当常见——比如Ras基因家族作为人类癌症中最常突变的癌基因，其突变版本也存在于许多健康组织内。这形成了一个科学悖论：为什么这些携带"致癌炸弹"的细胞大多安分守己，仅极少数会最终发展为肿瘤？显然，突变本身并不足以引发癌症，还需要其他因素的推波助澜。其中，细胞表型可塑性（指细胞改变其身份和特性的能力）和炎症微环境被认为是肿瘤发生的两个关键推手，但它们在肿瘤起始阶段何时、如何被触发，以及如何相互作用，始终是未解之谜。

为了捕捉肿瘤起始的"最初瞬间"，爱丁堡大学的Yi Feng团队在《Cell Reports》上发表了创新性研究。他们利用可诱导的斑马鱼模型，在幼虫表皮中特异性激活人类HRAS^G12V致癌基因（皮肤鳞状细胞癌中的常见突变），并借助单细胞RNA测序（scRNA-seq）和活体成像技术，首次全景式解析了癌基因激活后24小时内的细胞内在变化和宿主免疫反应。

研究人员主要运用了四大关键技术：一是可诱导转基因斑马鱼模型（Tg(krtt1c19e:KALTA4-ERT2; UAS:FP-HRAS^G12V)），通过4-羟基他莫昔芬精确控制致癌基因在表皮基底层的激活时机；二是单细胞RNA测序，在8和24小时两个时间点对荧光激活细胞分选（FACS）分离的表皮和免疫细胞进行转录组分析；三是活体时间 lapse成像，直观观察细胞行为和细胞间相互作用；四是杂交链式反应荧光原位杂交（HCR FISH），在完整幼虫中验证关键基因的表达模式。此外还运用了细胞谱系追踪、药理学干预和基因敲降等多种手段。

细胞起源决定了对致癌性Ras的响应

研究证实，基底角质形成细胞对HRAS^G12V的敏感性远高于表层角质形成细胞。诱导24小时后，基底细胞来源的癌前细胞（PNCs）形成了四个转录组状态截然不同的亚群，而表层细胞则保持相对稳定的身份。这表明细胞的起源身份（"土壤"）决定了其对致癌信号（"种子"）的响应。

同基因型PNCs在24小时内向不同细胞状态分化

scRNA-seq分析揭示了一个动态演变过程：PNC-1（8小时）代表早期应激响应；PNC-2作为分支点；PNC-3高表达细胞迁移、侵袭和部分上皮-间质转化（pEMT）相关基因；PNC-4则走向终末分化。伪时间分析显示，PNC-2是分化的岔路口，一条路通向具有侵袭特征的PNC-3，另一条则通向分化方向的PNC-4。活体成像和HCR FISH验证了PNC-3标志物lamc2和PNC-4标志物cldna的表达互斥，且在空间上cldna+细胞位于lamc2+细胞上方，暗示了克隆内的命运分歧。

Ras驱动的PNCs去分化为类胚胎状态

与正常基底细胞相比，所有PNC集群均下调了基底细胞标志物和分化相关基因，同时上调了胚胎期表皮干细胞标志物。尽管p63（表皮谱系主调控因子）表达维持，但其激活的下游基因却下调了。基因集富集分析显示，与分化、发育相关的通路被抑制，而表观遗传调控通路被激活，包括dmnt1、ezh2等多个已知能维持干细胞干性的染色质修饰因子。这表明HRAS^G12V诱导了快速的去分化，使细胞退回至更原始、更具可塑性的状态。

PNCs亚群经历pEMT并类似CSCs

PNC-3细胞高表达与细胞迁移（如arp2/3复合体成员）、侵袭（如mmp9, mmp13a）和pEMT（如snai2）相关的基因，但保留了上皮标志物（如cdh1），符合部分EMT特征。同时，它们特异性表达癌症干细胞（CSC）标志物（如cd44a, thy1）和鼠类cSCC中鉴定的CSC标志物。活体成像显示约30%的PNCs在24小时时呈现伸长形态和伪足，具有运动能力。这些细胞增殖活性较低，与CSCs特性一致。重要的是，krt18a（CSC标志物）在部分lamc2+ PNCs中表达，且常成簇出现，提示克隆性扩张。

不同的PNC状态对应于人类肿瘤中的亚群

通过将斑马鱼数据与人类皮肤鳞状细胞癌（cSCC）scRNA-seq数据整合分析，发现PNC-4与已分化的肿瘤细胞共聚类，而PNC-3则与位于肿瘤侵袭前沿的"肿瘤特异性"侵袭细胞群高度相似。生存分析进一步证实，PNC-3基因特征在17种癌症（尤其是RAS突变驱动的癌种如胰腺癌、肺癌等）中与患者不良预后显著相关。

中性粒细胞是响应Ras驱动肿瘤起始的首批免疫细胞

PNCs，特别是PNC-3细胞，在癌基因激活后迅速上调多种细胞因子和趋化因子，如il1b、csf3b（G-CSF）、cxcl8a/b（IL-8）等。活体成像显示，中性粒细胞在5小时（最早可检测到PNCs时）即被招募至表皮，并持续与PNCs相互作用。而巨噬细胞虽在表皮常态巡逻，但其与PNCs的明显互动要到16小时后才出现，且scRNA-seq显示巨噬细胞在24小时时并未表现出典型的肿瘤相关巨噬细胞（TAM）特征。

Ras驱动的PNCs引发系统性粒细胞生成改变并促进肿瘤相关中性粒细胞表型

对中性粒细胞的scRNA-seq分析揭示了系统性重编程：HRAS幼虫的中性粒细胞显示出加速的"应急性粒细胞生成"特征——幼稚群体比例改变，细胞周期基因上调，稳态调控因子cebpa下调而应急调控因子cebpb上调。同时，中性粒细胞普遍上调了免疫抑制相关基因（如arg2, ptges3b），而非经典促炎基因。利用arg2报告基因斑马鱼模型，在体内证实了被招募至PNCs处及在造血组织中的中性粒细胞arg2表达升高。这表明PNCs分泌的信号（如csf3b）系统性地改变了中性粒细胞的发育和功能，使其偏向促肿瘤表型。

不成熟和成熟中性粒细胞均被招募并以类似方式响应

通过lyz（标记不成熟）和myd88（标记成熟）双报告基因系统，发现不成熟和成熟中性粒细胞均被招募至PNCs处，但行为不同：不成熟中性粒细胞迁移速度较慢，在PNCs附近停留时间更长。转录组上，除处于扩增阶段的中间群（H2）外，不同成熟度的中性粒细胞对PNCs的响应基因高度重叠，包括细胞周期、蛋白质加工、炎症信号等通路，但同时保持了各自的发育状态特征。

PNCs与中性粒细胞间的互惠相互作用促进PNC增殖和EMT特征

中性粒细胞更倾向于与发生pEMT的lamc2+ PNC-3细胞长时间接触。功能实验表明，通过吗啉寡核苷酸或CRISPR/Cas9（ crispant ）敲降中性粒细胞受体csf3r，导致中性粒细胞减少后，PNCs的Edu掺入（增殖指标）显著降低，凋亡增加，但lamc2+ PNCs的比例反而上升，提示中性粒细胞对PNC增殖和存活至关重要，并可能影响其表型。虽然药理学抑制cxcl8-cxcr1/2轴未能显著阻断中性粒细胞招募，但轻微减少了中性粒细胞-PNC接触和PNC增殖，表明该信号轴是调控二者互作的组成部分。

本研究首次在体内以单细胞分辨率捕捉了癌基因激活后24小时内发生的戏剧性变化，挑战了传统观点：恶性特征（如可塑性、EMT、迁移）和促瘤炎症并非仅在肿瘤晚期或积累多次突变后才出现，而是可以在癌基因"第一推动"下，在许可的细胞背景中迅速协同涌现。基底角质形成细胞作为"许可细胞"，其干细胞特性使其易于被Ras重编程，快速产生具有CSC和侵袭特征的细胞亚群（PNC-3）。这些细胞不仅自身具有高恶性潜能，还主动分泌信号，系统性地"教育"和招募中性粒细胞，形成促瘤微环境，而中性粒细胞反过来滋养PNCs，形成正反馈循环。这项研究为理解肿瘤起始的极早期事件提供了全新视角，强调了细胞内在可塑性与免疫微环境在肿瘤发生中的早期且紧密的耦合关系，为癌症的早期干预和预防策略提供了潜在靶点。