耶氏肺孢子菌与重症肺炎患者肺病毒组的关联研究揭示其定植作为感染过渡状态的关键作用

《iScience》：Pneumocystis jirovecii associated with Lung Virome in patients with severe pneumonia

本研究通过临床宏基因组学分析1737例肺炎患者队列，发现耶氏肺孢子菌(P. jirovecii)在重症肺炎中广泛定植，且其存在与肺病毒组丰度显著相关。研究人员通过回顾性多中心研究和ICU插管患者验证队列，首次揭示P. jirovecii定植可能是从阴性到感染的过渡阶段，并在CMV阳性患者中与28天死亡率显著相关，为肺炎发病机制提供了新的微生物生态学视角。

　　

在重症监护病房中，耶氏肺孢子菌(Pneumocystis jirovecii, P. jirovecii)引起的肺炎一直是免疫抑制患者面临的严重威胁。尽管抗感染治疗能够缓解病情，但PCP的治疗仍然充满挑战，且复发率较高。更为复杂的是，这种真菌病原体能够在宿主体内长期定植，通过改变其主要表面糖蛋白等方式与宿主共同进化，一旦免疫功能下降即可重新激活导致PCP发生。

肺微生物组是一个复杂而动态的生态系统，由细菌、真菌、病毒等相互作用的群落组成。虽然肺部微生物数量远少于肠道，但呼吸道微生物群的稳定性被认为是防止病原体扩张的必要条件。先前的研究主要集中在肺部细菌微生物组，而真菌和病毒这两个"被忽视"的生态系统成员的研究相对不足。特别是PCP与肺部真菌和病毒微生物组之间的关联尚未有系统研究。

为了解决这一知识空白，浙江大学医学院附属第一医院黄元秀、魏欣等研究人员在《iScience》上发表了最新研究成果。研究团队提出了一个创新性假设：在P. jirovecii定植和感染患者肺部存在特定的微环境，为P. jirovecii的繁殖提供了必要条件。通过分析微生物丰富度、群落组成和功能变化，可以更深入理解肺部微生物组与PCP之间的关联，为寻找新的治疗靶点提供重要依据。

研究团队构建了两个多中心队列开展系统研究。在队列1中，他们回顾性分析了17个医疗中心1737例接受支气管肺泡灌洗液临床宏基因组学检测的患者数据和临床信息。队列2则通过宏基因组下一代测序对72例肺部感染患者（包括P. jirovecii感染17例、P. jirovecii定植19例和匹配的P. jirovecii阴性36例）的BALF进行微生物组分析，深入探讨P. jirovecii感染与肺部微生物群落的关联。

研究采用的主要技术方法包括：多中心临床宏基因组学检测、支气管肺泡灌洗液样本采集与DNA提取、宏基因组下一代测序技术、倾向评分匹配分析、微生物多样性分析（α和β多样性）、冗余分析、Spearman相关性分析以及28天生存分析。样本来源为17个医疗中心的1737例肺炎患者和72例ICU重症肺炎患者的回顾性队列。

队列1中P. jirovecii定植和感染与真菌和病毒微生物组的关联

在1897例接受商业临床宏基因组学检测的患者中，958例患者中鉴定出真菌物种。这一过程揭示了三个门，包括子囊菌门、担子菌门和毛霉门，以及41个物种。检测到的前四个真菌属分别是假丝酵母菌属、曲霉菌属、肺孢子菌属和Nakaseomyces属。其中P. jirovecii在每个城市都以不同比例被广泛检测到。

经过倾向评分匹配后，队列1纳入了三组患者：P. jirovecii感染组90例、P. jirovecii定植组62例和匹配的P. jirovecii阴性组302例。当将所有不含P. jirovecii的微生物群纳入PCoA分析时，三组之间存在显著的组间差异。P. jirovecii感染组的PCoA图部分与P. jirovecii定植组重叠。使用RDA分析群落组成与环境因素之间的关系显示，样本明显分组显示，影响病毒组的最显著因素是P. jirovecii。

通过Spearman相关分析，多中心队列显示P. jirovecii检测与不同病毒、真菌、细菌和其他物种之间存在相关性。巨细胞病毒人类β5型和扭矩特诺病毒的检测率在P. jirovecii阴性组和P. jirovecii定植组中逐渐升高。

队列2中组间细菌微生物组组成无差异

为验证P. jirovecii感染与病毒组之间的相关性，总共招募了72例住院重症肺炎患者作为队列2。在细菌水平上，α多样性指数显示三组之间无显著差异。基于Bray-Curtis距离的主坐标分析表明，在细菌水平上P. jirovecii感染组、P. jirovecii定植组和P. jirovecii阴性组之间无显著差异。分析BALF细菌群落中优势类群的相对比例发现，其主要由无色杆菌、鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌、嗜麦芽窄食单胞菌、缺陷无色杆菌、木糖氧化无色杆菌和铜绿假单胞菌组成。

队列2中真菌和病毒微生物组在组间存在差异，且按免疫状态呈现不同模式

生物信息学分析产生了各种真菌OTU。基于香农多样性指数的α多样性分析估计，P. jirovecii阴性组显示出最低的真菌多样性。这三组的Chao1指数和Simpson指数也显著不同。基于Bray-Curtis距离的主坐标分析显示各实验组明显分离。相似性分析结果也表明三组之间微生物组成存在显著差异，这与之前在队列1中获得的结论相似。

在物种水平上观察到的优势真菌包括黄曲霉、白色假丝酵母、尖孢镰刀菌、米根霉、德莱玛根霉和松针锈菌等。正如预期的那样，三组之间P. jirovecii的相对丰度存在显著差异。此外，尖孢镰刀菌在三组之间的相对丰度也呈现显著变化，进一步支持了与P. jirovecii状态相关的独特真菌群落变化。

对于病毒组分析，P. jirovecii阴性组具有最低的α多样性。此外，与其他两组相比，P. jirovecii阴性组的总病毒相对丰度最低。对于β多样性，使用Bray-Curtis距离的PCoA分析揭示了物种水平上肺部病毒微生物组的显著变化。在免疫正常和免疫抑制患者中，P. jirovecii阴性组具有最低的病毒α多样性。在免疫抑制患者中，定植组通过香农指数显示出中间多样性。对于β多样性，病毒组成在免疫正常患者中没有显著差异。然而，在免疫抑制患者中，定植组表现出中间的病毒特征。

根据物种丰度表和注释表，选择优势类群进行分类。P. jirovecii感染组和P. jirovecii定植组中的优势微生物群包括单纯病毒人类α1型、巨细胞病毒人类β5型、指环病毒科物种、淋巴隐病毒人类γ4型等。在P. jirovecii阴性组中，巨细胞病毒人类β5型、指环病毒科物种和淋巴隐病毒人类γ4型的丰度显著低于P. jirovecii感染组。

队列2中病毒和真菌微生物组的相关性分析及组间KEGG差异

进行Spearman相关分析以评估物种水平的关系。P. jirovecii感染富集物种与巨细胞病毒人类β5型、扭矩特诺病毒和尖孢镰刀菌呈显著正相关，而与Apiotrichum montevideonse呈负相关。KEGG通路富集分析揭示了组间功能特征的差异。与阴性组相比，P. jirovecii感染组在与氧化磷酸化、化学致癌作用、糖尿病心肌病和其他疾病相关的通路中富集。相比之下，感染组在一般代谢功能通路中的丰度显著降低，包括代谢通路、次级代谢物的生物合成和微生物代谢。与P. jirovecii阴性组相比，感染组在疾病相关通路中也显示出丰度增加，包括糖尿病心肌病、肌萎缩侧索硬化症和亨廷顿病，而在一般代谢功能中丰度降低，如代谢通路、次级代谢物的生物合成和微生物代谢。

支气管肺泡灌洗液微生物组组成与临床指标的关系

为研究真菌和病毒微生物组组成与宿主健康状态之间的关系，进行了单个物种丰度与临床指标之间的Spearman相关性分析。发现多个临床指标与肺部微生物组密切相关，包括年龄、免疫抑制、结缔组织病、肾功能不全、实体肿瘤、移植和呼吸功能障碍等。在最丰富的30个属中，肺孢子菌属、指环病毒科物种与免疫抑制、肾功能不全和移植呈正相关；巨细胞病毒人类β5型和Alphatorquevirus与免疫抑制和移植呈正相关；肺孢子菌属和Geoglossum与呼吸功能障碍呈负相关；马拉色菌属、酵母属、Massospora、Epichloe与结缔组织病呈负相关。

通过冗余分析研究了细菌、真菌丰度和临床指标对病毒群落的影响。前两个成分解释了病毒组成总方差的55.11%。P. jirovecii、白色假丝酵母和无色杆菌属的丰度、免疫抑制、移植和年龄的影响被认为解释了P. jirovecii感染组、定植组和阴性组之间病毒组成的区别。P. jirovecii对病毒群落的影响最大。与队列1相似，样本明显分组，表明P. jirovecii定植可能是从P. jirovecii阴性到P. jirovecii感染的过渡阶段。

此外，研究选择了代表性的巨细胞病毒人类β5型和淋巴隐病毒人类γ4型，探讨了病毒和P. jirovecii阳性对队列1中1737例患者28天全因死亡率的影响。在CMV阳性但未接受阿昔洛韦、更昔洛韦或缬更昔洛韦治疗的个体中，28天死亡率与P. jirovecii阳性显著相关。然而，在队列1中CMV阴性或CMV阳性接受抗疱疹病毒治疗的患者中，P. jirovecii阳性与28天死亡率无关。在队列1中EBV阳性个体中也发现了类似结果。应用IPTW减少混杂后，P. jirovecii阳性与28天死亡率之间的关联在CMV阳性患者中仍然显著，但在其他组中未观察到这种关联。

本研究强调了P. jirovecii感染后肺部微生物组之间相互作用的复杂性。在两个队列中，即使在调整了免疫抑制、疾病严重程度和先前显示与免疫抑制相关的各种微生物等因素后，P. jirovecii仍然是与病毒组变化相关的最重要微生物。P. jirovecii定植可能诱导肺部微环境改变并破坏肺部微生物组，这可能为潜在病原体的入侵提供机会。研究结果增强了我们对导致P. jirovecii感染相关肺炎的集体机制的理解，这是开发治疗和管理多微生物感染方法的重要一步。

研究也存在一些局限性，包括BALF样本采集程序的标准化问题、低生物量标本微生物组分析中污染DNA的影响、qPCR和NGS结果不一致的情况、RNA病毒未纳入分析以及各种治疗因素对肺部微生物组的影响等。尽管如此，这项研究为理解P. jirovecii在肺部微生物生态系统中的作用提供了重要见解，为未来研究奠定了基础。