综述：3D微晶电子衍射在跨膜蛋白结构解析中的进展

《Biophysical Journal》：Advances of 3D microcrystals electron diffraction for transmembrane protein structure determination.

本综述系统阐述了MicroED（3D微晶电子衍射）技术在跨膜蛋白结构解析中的最新进展。文章重点介绍了该技术在样品制备（如FIB研磨、LCP结晶）、数据收集策略（如低剂量成像、能量过滤）方面的突破，并强调其相较于X射线衍射（可解析更小晶体、定位氢原子）和冷冻电镜（适用于小分子量蛋白）的独特优势。综述指出MicroED已成为补充传统结构生物学方法的重要工具，尤其在膜蛋白等挑战性靶点研究中展现巨大潜力。

　　

引言

微晶电子衍射（MicroED）作为一种新兴的结构生物学技术，近年来在蛋白质结构解析领域获得广泛认可。该技术利用电子束与纳米级三维晶体相互作用产生的衍射图案进行结构解析，有效克服了X射线衍射对晶体尺寸的严苛要求。与主要与原子电子云相互作用的X射线不同，电子同时受原子核和电子云影响，这种强相互作用使MicroED具备独特优势：不仅能从亚微米级晶体中获取高分辨率数据，更可定位氢原子等轻元素位置，揭示蛋白质中的氢键网络和原子电荷状态。尽管存在动力学散射等挑战，通过统计校正和优化数据采集策略已能有效缓解其影响。

生物样品制备进展

MicroED实验成功的关键在于高质量样品的制备。整个过程需将亚微米厚度的蛋白质晶体在EM载网上进行玻璃化冷冻。典型流程包括晶体悬液点样、多余液体吸除和乙烷快速冷冻等步骤。其中冰层厚度控制至关重要——过厚会降低信噪比，过薄则无法维持蛋白质水合状态。值得注意的是，最新研究表明通过石墨烯液体池技术可在室温下对非玻璃化冷冻的溶菌酶纳米晶体进行电子衍射数据采集。

当前样品制备仍面临多重挑战：晶体尺寸调控、载网类型选择、晶体转移方法、吸滤参数（时间、力度、湿度、温度）优化等。对于不易形成纳米晶体的蛋白质，可通过调整结晶条件（如引入晶种）或物理破碎（超声、涡旋）等方式获得合适尺寸的晶体。对于脆性较高的膜蛋白晶体，聚焦离子束（FIB）研磨技术成为关键手段，可将大晶体精确定向削薄为100-300纳米的薄层。研究表明，预先进行铂涂层保护和最终抛光处理能显著提升薄层存活率和数据质量。

针对晶体转移过程中的取向偏好问题，悬浮滴结晶术实现了蛋白质在载网上的直接生长。而对于高粘度样品（如脂质立方相LCP结晶），压力辅助吸滤、皮升级微量点样等技术正在逐步解决传统方法导致的晶体损伤问题。在数据采集前，采用配备低温台的光学干涉显微镜可对载网冰层厚度进行快速评估，有效提升电镜使用效率。

膜蛋白结构解析应用

MicroED在膜蛋白研究领域展现出独特价值。早期电子衍射研究已成功解析细菌视紫红质（bR）和光捕获色素蛋白复合体（LHC-II）等二维晶体结构。近年来随着技术成熟，三维晶体结构解析取得突破性进展：水通道蛋白AQP0的闭合构象、钠钾离子通道NaK的新构象态、血管加压素1B受体等新型结构的成功解析，彰显了MicroED在膜蛋白研究中的巨大潜力。

膜蛋白研究长期受限于表达量低、纯化困难、结晶难度大等挑战。虽然脂质立方相（LCP）结晶技术取得了一定成功，但由此产生的微型晶体给传统结构解析方法带来困难。MicroED凭借其低样品消耗量和对小分子量蛋白（<40 kDa）的解析能力，为膜蛋白结构研究提供了新途径。针对LCP样品的高背景噪声问题，结合集成荧光显微镜（iFLM）的等离子聚焦离子束（pFIB）技术可实现晶体精准定位和薄层制备，其中氙、氩等离子源较传统镓离子源能更好保持晶体完整性。

数据采集与处理策略

MicroED数据采集通常在透射电镜（TEM）衍射模式下进行。专业电子衍射仪（如Eldico Scientific AG产品）虽简化了硬件配置，但目前仍难以满足蛋白质大晶胞的检测需求。优化的工作流程包括：低剂量（<10^-6 e?^-2s^-1）预筛选、晶体对中、选区光阑匹配等关键步骤。为减少辐射损伤，需采用快速扫描和低剂量率（0.01-0.05 e?^-2s^-1）采集策略，电子计数探测器与能量过滤器的应用可显著提升数据质量。

数据采集方法主要有连续旋转法和串行电子衍射法（SerialED）。自动化采集软件（如SerialEM、Instamatic等）的快速发展正推动技术普及。数据处理方面，虽然现有X射线衍射软件（MOSFLM、XDS等）可进行基本处理，但专门针对电子衍射特点开发的PETS软件能更准确处理动力学散射效应。相位解析主要依赖分子置换（MR）、AlphaFold预测模型辅助等方法，直接法也在高分辨率数据中取得成功。

结论

自2013年首个溶菌酶三维结构解析以来，MicroED技术已完成从概念验证到实际应用的跨越。目前PDB数据库中已有逾百个通过电子衍射解析的蛋白质结构，其中约26个为三维晶体结构，包含6个膜蛋白结构。该技术正逐步应用于反应中间体捕获等机理研究领域，超快电子衍射等前沿技术开发将进一步拓展其在蛋白质动态研究中的应用前景。随着专业设施（如钻石光源eBIC、加州大学洛杉矶分校MicroED核心设施）的建立和技术标准的完善，MicroED有望成为结构生物学领域更普及的强大工具。