表达EV-D68病毒样颗粒的mRNA疫苗诱导强效中和抗体并有效预防感染

《Molecular Therapy Nucleic Acids》：mRNA vaccine expressing enterovirus D68 virus-like particles induces potent neutralizing antibodies and protects against infection

本研究针对肠道病毒D68(EV-D68)引起的儿童呼吸道疾病及急性弛缓性脊髓炎(AFM)缺乏有效疫苗的难题，开发了一种表达EV-D68病毒样颗粒(VLP)的mRNA疫苗。研究发现该疫苗在小鼠模型中诱导了优于灭活全病毒颗粒(IWV)疫苗的血清中和抗体反应，并在呼吸道黏膜产生IgA和IgG抗体，有效预防EV-D68感染及瘫痪症状。此外，疫苗通过CD8+ T细胞反应对柯萨奇病毒B3(CVB3)产生交叉保护作用，为防控EV-D68及相关肠道病毒感染提供了新策略。

　　

近年来，肠道病毒D68(EV-D68)已成为全球儿童健康的重要威胁。这种病毒主要通过呼吸道传播，可引起从轻微咳嗽到严重肺炎的呼吸道症状，更令人担忧的是，它还是急性弛缓性脊髓炎(AFM)的主要病因，这种疾病能在数小时至数天内导致患者瘫痪。自2014年全球爆发超过2000例病例以来，EV-D68持续在世界范围内传播。尽管该病毒的危害性日益凸显，但目前尚无特定的抗病毒治疗或预防疫苗可用。

面对这一挑战，大阪大学的研究团队开发了一种创新的mRNA疫苗策略。传统疫苗开发面临诸多限制，如灭活疫苗的生产效率受病毒株依赖性影响，而病毒样颗粒(VLP)疫苗虽能模拟病毒结构但免疫原性有限。mRNA疫苗技术的出现为传染病防控带来了新希望，其在SARS-CoV-2疫情防控中的成功应用证明了该平台在诱导强效抗体和T细胞反应方面的优势。

研究人员首先探索了针对EV-D68 VP1蛋白的mRNA疫苗潜力，但发现即使通过添加信号肽实现蛋白分泌，这些疫苗也只能诱导EV-D68特异性IgG，而无法产生中和抗体。进一步分析表明，这可能与VP1蛋白的翻译后修饰有关，这些修饰改变了中和表位的结构。

研究团队随后转向更复杂的VLP策略。EV-D68 VLP由结构蛋白前体P1经病毒蛋白酶3CD切割后组装而成，能模拟病毒颗粒结构但不含遗传物质，安全性高。研究人员设计了两条分别编码P1和3CD的mRNA，通过脂质纳米颗粒(LNP)递送系统进行肌肉注射。

实验证实，这种mRNA疫苗能在体内外成功表达并组装成VLP。免疫原性评估显示，VLP mRNA疫苗能诱导高水平的EV-D68特异性IgG和中和抗体，且效果显著优于传统灭活疫苗。值得注意的是，抗体反应持久，在免疫后5个月内保持稳定。

在保护效果方面，该疫苗展现出全面优势。攻毒实验表明，免疫小鼠后，鼻腔和肺部的病毒载量显著降低；通过被动血清转移实验，证明疫苗诱导的抗体能有效预防EV-D68引起的瘫痪并提高生存率。特别重要的是，疫苗还能在呼吸道黏膜诱导IgA和IgG抗体，这对防御呼吸道病原体至关重要。

疫苗的另一重要特点是其交叉保护潜力。研究发现，该疫苗对EV-D68的不同进化支(B1、B2、B3和D)均能诱导交叉中和抗体，且效果优于灭活疫苗。更令人惊喜的是，疫苗通过诱导针对3CD蛋白的CD8⁺ T细胞反应，能对另一种肠道病毒CVB3产生保护作用，表明其可能具有广谱防控潜力。

研究采用的主要技术方法包括：mRNA体外转录与脂质纳米颗粒封装技术、病毒样颗粒组装与表征技术、小鼠免疫模型与攻毒实验、血清学分析（ELISA、中和试验）、黏膜抗体检测、酶联免疫斑点(ELISpot)分析以及T细胞反应评估。

mRNA疫苗表达VLP诱导针对EV-D68的中和抗体

研究人员通过共转染P1和3CD mRNA，在HEK293细胞中成功表达了EV-D68 VLP。蔗糖密度梯度离心分析证实，表达产物与空病毒颗粒具有相似的沉降特性，表明VLP正确组装。小鼠肌肉注射实验进一步验证了VLP在体内的表达。

mRNA疫苗表达VLP诱导的中和抗体水平高于IWV

剂量反应实验显示，mRNA疫苗在诱导EV-D68特异性IgG（包括IgG1、IgG2a和IgG2b亚型）和中和抗体方面均优于灭活疫苗。即使是低剂量mRNA疫苗，其效果也与高剂量灭活疫苗相当或更优。抗体持久性实验表明，mRNA疫苗诱导的免疫反应能长期维持。

mRNA疫苗表达VLP对EV-D68感染具有保护作用

攻毒实验证明，免疫小鼠后，鼻腔和肺部的病毒载量显著降低。通过被动血清转移至新生小鼠，疫苗免疫血清能完全预防EV-D68引起的瘫痪和死亡，并显著降低脊髓中的病毒载量。

黏膜IgG和IgA由表达VLP的mRNA疫苗诱导

研究发现，肌肉注射mRNA疫苗能在鼻腔清洗液和支气管肺泡灌洗液中诱导EV-D68特异性IgG和IgA抗体，且水平显著高于灭活疫苗。酶联免疫斑点实验证实，鼻腔组织中存在抗体分泌细胞，提示局部免疫应答参与其中。

CD8⁺ T细胞介导的对柯萨奇病毒B3(CVB3)的交叉保护

疫苗免疫小鼠的脾细胞在3CD蛋白刺激下产生干扰素γ(IFN-γ)，表明特异性T细胞应答被激活。用3CD mRNA免疫的小鼠在CVB3攻击下体重下降显著减轻，且这种保护作用依赖于CD8⁺ T细胞。

本研究首次报道了针对EV-D68的mRNA疫苗平台，该平台通过表达VLP诱导了强效且持久的免疫保护。与传统灭活疫苗相比，mRNA疫苗在诱导全身和黏膜免疫应答方面表现出显著优势，且对多种EV-D68毒株具有交叉保护潜力。更重要的是，疫苗还能通过T细胞应答对其他肠道病毒产生交叉保护，为开发广谱抗肠道病毒疫苗提供了新思路。

该研究的成功不仅为EV-D68的防控提供了有前景的候选疫苗，也展示了mRNA疫苗平台在应对新发传染病方面的巨大潜力。由于VLP组装机制在肠道病毒中高度保守，该平台可进一步推广至EV-A71、柯萨奇病毒A6和A16等其他重要病原体的疫苗开发，有望为应对肠道病毒感染这一全球公共卫生挑战提供创新解决方案。