基于甲醇固定驱动的独特根瘤菌样机制：杨梅甲基杆菌系统性定殖松树宿主的新发现

《Plant and Cell Physiology》：A Shoot Endosymbiont Colonizes Pine Host By Unique And Rhizobia-Like Mechanisms Boosted By Surface-Fixed Methanol

本研究针对松树芽内共生甲基营养菌Methylorubrum extorquens DSM13060的定殖机制这一空白问题，通过多模态显微技术揭示了该内共生菌通过根鞘和茎气孔侵入、利用表面甲醇激活mxaF启动子合成抗氧化物质PHB、并形成类感染线程穿越内皮层进入木质部的独特定殖路径。该研究首次阐明了林木芽内共生菌的系统性定殖策略，为理解植物-微生物互作提供了新模式。

　　

在广袤的北方森林中，苏格兰松（Pinus sylvestris L.)以其卓越的环境适应能力跨越从西欧至西伯利亚的广阔地域。这种成功背后隐藏着一个秘密武器：与内生微生物的共生联盟。其中，杨梅甲基杆菌（Methylorubrum extorquens DSM13060）作为一种特殊的芽内共生菌，能够定居在松树分生组织的细胞内，调控宿主发育并增强抗逆性。然而，这种内共生菌如何突破植物防线进入关键组织领域，一直是未解之谜。

传统认知中，甲基营养菌主要栖息于叶际（phyllosphere），利用植物释放的甲醇作为碳源。但M. extorquens DSM13060展现了非凡的能力——它不仅定殖于松树芽部细胞，还能促进侧根形成和生物量积累，且不依赖典型植物激素途径。更引人注目的是，该菌能通过甲醇代谢产生多羟基丁酸酯（PHB），并在侵染过程中将其降解为具有抗氧化活性的寡聚物，这可能是其成功定殖的关键策略。尽管如此，该菌从植物表面到芽部分生组织的完整定殖路径仍如黑箱般未被揭示。

为解决这一难题，芬兰奥卢大学生态与遗传研究单元的Janne J. Koskim?ki团队在《Plant and Cell Physiology》上发表了创新性研究。研究人员通过构建双荧光报告系统（GFP/mCherry），结合低温切片和共聚焦显微镜技术，首次全景式解析了M. extorquens DSM13060在松树幼苗中的时空定殖动态及甲醇利用模式。

研究团队采用的关键技术方法包括：构建含组成型GFP和mxaF启动子控制mCherry的双重标记菌株；建立松树无菌幼苗-细菌共生体系并进行长达730天的跟踪观察；应用共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）进行多通道荧光成像；利用尼罗蓝A染色检测PHB颗粒；通过场发射扫描电镜（FE-SEM）观察表面定殖形态；采用吖啶橙-溴化乙锭（AO-EB）双染色评估组织活性。

Colonization of roots

研究发现，细菌定殖始于根部，7天 post-inoculation (dpi) 即在根表面形成微小菌落。M. extorquens DSM13060在圆柱鞘（cylindrical sheath）——一种覆盖初生根表皮的活细胞层中形成类感染口袋（infection pocket-like）结构。通过直接穿透细胞壁或形成垂直延伸的菌落，细菌在50-80 dpi时已在圆柱鞘与表皮间形成生物膜样结构。

Transition zone

圆柱鞘在过渡区（transition zone）的定殖中扮演关键角色，其不规则排列的细胞为细菌提供了大量定殖空间。60 dpi时，该区域的细菌丰度显著高于根、茎或针叶。

Colonization of stem

茎部定殖速度较慢，≥40 dpi时在下部茎表面出现圆形微菌落。细菌通过气孔开口侵入，在表皮下方形成感染口袋，然后逐步向维管组织扩散。

Route to the apex

研究发现了两种入侵方式：渐进的细胞间传播和类感染线程（infection thread-like）结构。后者使细菌能够穿越皮层和内皮层进入维管组织。≥40 dpi时，单个细菌细胞出现在木质部导管中，表明维管系统是细菌通往顶端分生组织的主要通道。≥90 dpi时，细菌成功定殖于芽部分生组织细胞。

Viability of colonized tissue

通过AO-EB染色评估发现，细菌定殖过程中未引发宿主细胞死亡，表明这是一种非破坏性的共生关系。

Bacterial mxaF activity

mxaF启动子活性分析显示，细菌在植物表面的甲醇利用活性最高，特别是在圆柱鞘和表皮定殖早期（7-14 dpi）。随着定殖深入，内部组织中的mxaF活性显著降低，表明甲醇主要在外围组织中被利用。

PHB检测结果表明，甲醇同化产物主要积累于根鞘、表皮和外皮层细胞，与mxaF活性区域高度一致。

研究结论表明，M. extorquens DSM13060对松树的定殖是系统性的，圆柱鞘和茎部气孔是主要入侵位点。该过程具有独特特征：无组织破损的穿透、在活细胞内的增殖、以及类根瘤菌的感染结构形成。细菌在植物表面固定甲醇合成PHB，为组织穿透提供抗氧化保护。深入组织内部后，细菌转换碳源利用策略，可能在缺乏甲醇的环境中利用苹果酸等物质。

该研究首次揭示了林木芽内共生菌的完整定殖路径，突破了传统认为内共生菌主要定殖根部的认知。发现的圆柱鞘定殖机制为植物-微生物互作研究提供了新视角。甲醇利用与抗氧化策略的关联为开发基于甲基营养菌的植物促生技术奠定了理论基础。与根瘤菌定殖机制的相似性表明，这种松树-甲基菌共生关系可能代表了一种新型的高度互惠共生模式，对理解森林生态系统微生物功能具有重要意义。