葡萄牙南部海岸入侵藻类Asparagopsis armata的季节性化学成分变化与抗菌活性研究及其生物技术应用前景

《Algal Research》：Seasonal variation in chemical composition and antimicrobial activity of Asparagopsis armata from the southern Portuguese coast: Insights for biotechnological applications

本研究针对入侵藻类Asparagopsis armata对海洋生态的威胁，开发了绿色蒸汽蒸馏提取方法，系统评估其水基提取物（hydrolates）的季节性抗菌活性变异。研究发现春季和秋季采集的样品具有双峰式生物活性模式，GC-MS和NMR分析揭示卤甲烷（尤其是溴仿bromoform）为主要挥发性有机物，但其单独浓度不足以解释抗菌活性，提示提取物中存在协同作用。该研究为开发新型抗菌药物提供了技术路线，同时通过生物勘探和蓝色生物经济方法为入侵物种的资源化利用提供了可持续策略。

　　

海洋生态系统正面临着前所未有的挑战，全球气候变化导致海水温度持续上升（每十年升高0.88°C），这种变化显著影响了海洋生物的生理过程。随着"热带化"趋势的加剧，原本栖息于特定热生态位的物种被迫适应新环境，导致群落组成发生快速变化。在这一背景下，非本地物种（NIS）的入侵问题日益突出，它们往往在更温暖、更多变的环境中茁壮成长，对当地生物多样性构成严重威胁。

葡萄牙海岸线作为生态多样性的热点区域，南部海域以温暖、营养贫乏的海水为特征，而北部海岸则支持着较冷、营养丰富的水域。然而，作为碳汇和育苗栖息地发挥关键生态作用的海藻林正在衰退。在葡萄牙水域，非本地入侵物种正在改变本地动植物的组成，同时无法履行被取代本地物种的功能角色，导致潜在的生物多样性丧失。

在众多入侵物种中，红藻Asparagopsis armata Harvey 1855尤为引人关注。这种原产于澳大利亚和新西兰的藻类自1920年代被引入大西洋和地中海以来，已扩散到世界大多数温带和热带水域。其成功定殖归因于丰富的生物活性化合物库，这为其对抗其他海洋生物提供了显著的竞争优势。然而，这些生物活性化合物的生产和效力受到基因型、生命阶段、性别和环境条件等多种因素的影响。

面对这些日益严重的海岸环境威胁，开发既能控制这些有害入侵者又能创造经济价值的解决方案变得至关重要。这正是生物勘探和蓝色生物经济的关键目标。由Asparagopsis sp.引起的藻华可作为生物活性化合物的生物质来源，用于开发新型抗菌药物等应用，同时生物质收集有助于减轻入侵性带来的负面影响。

为探究Asparagopsis armata的生物活性潜力，由André Cairr?o、Stefano Nones等人组成的研究团队在《Algal Research》上发表了题为"Seasonal variation in chemical composition and antimicrobial activity of Asparagopsis armata from the southern Portuguese coast"的研究论文。该研究旨在开发绿色提取方法，生产A. armata提取物，表征其挥发性有机化合物（VOCs）含量，并评估其对多种微生物（包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌、丝状真菌和酵母菌）的抗菌潜力。

研究团队采用了一套完整的技术方法体系：通过优化阶段确定了最佳生物质处理（冷冻保存）和提取方法（反应器蒸汽蒸馏，RSD）；每月采集藻类样本进行系统性生物活性评估；使用微量肉汤稀释法和MTT（3-(4,5-二甲基-2-噻唑基)-2,5-二苯基四唑溴化物）代谢测定法评估抗菌活性；运用GC-MS（气相色谱-质谱联用）分析挥发性有机物谱；采用NMR（核磁共振）技术进行化学指纹图谱分析；并通过统计学方法（如ANOVA、PERMANOVA等）进行数据验证。

3.1. 最佳生物质来源和加工方法

研究人员首先通过初步测试优化实验条件，发现洗涤方法对水蒸馏（SSD）产生的hydrolates的抑制能力没有影响。冷冻的A. armata被确定为最合适的生物质来源，而通过反应器蒸汽蒸馏（RSD）产生的提取物产生了最具生物活性的hydrolates。与涉及生物质研磨和溶剂提取的几种先前使用的方法不同，RSD保留了藻类结构完整性，这可能影响提取物组成。

3.2. 抗菌活性的时间变异性

对2021年每月采集的样品分析显示，抗菌活性存在显著的时间变异。4月、5月和11月生产的hydrolates对所有四种测试微生物均表现出一致的生物活性。其中4月采集的藻类产生的hydrolates对所有微生物表现出最低的MIC₉₀（引起90%生长抑制的最小抑制浓度），表明具有最高的抗菌潜力。Spearman等级顺序相关性分析显示，pH值与MIC₉₀ vol/vol%呈正相关，而溴仿浓度呈负相关，表明大多数生物活性hydrolates的pH降低，而溴仿含量增加。

3.3. 不同生物活性程度hydrolates的化学景观表征

通过GC-MS和NMR对2011-2023年多个年份的15个水性藻类hydrolates的挥发性有机化合物（VOC）谱进行分析，发现具有高生物活性的hydrolates在溴仿、二溴碘甲烷、4-乙基苯甲醛、四溴化碳、一种未知卤代酯和三种未知化合物方面更加丰富。PCA（主成分分析）显示，具有高生物活性的hydrolates与具有低生物活性和无生物活性的hydrolates存在显著差异。

3.4. 溴仿对测试微生物的抗菌活性

为确定溴仿是否是hydrolates中观察到的抗菌活性的原因，研究人员测试了其在hydrolate样品中检测到的浓度范围内（高达0.720 mg·mL^-1）的效果。结果表明，在四种测试微生物（金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、烟曲霉和白色念珠菌）中均未检测到显著的生长抑制，表明可能是其他化合物负责hydrolate样品观察到的抗菌活性。

研究结论部分强调，A. armata的hydrolates的抗菌活性和化学谱显示出清晰的时间模式，支持了代谢物生产随季节变化的初始假设。具有较高生物活性的hydrolates与较低的pH水平和较高的溴仿浓度同时发生，尽管溴仿单独不能解释观察到的生物活性。

蒸汽蒸馏提取系统被证明是生产生物活性水基提取物的有效且可持续的方法。与使用溶剂提取技术的研究相比，该研究结果具有可比性，突出了蒸汽蒸馏系统作为环境友好方法学的可靠性。

MMSE-GC-MS（整体材料吸附萃取-气相色谱-质谱联用）由于hydrolates中VHOCs（挥发性卤代有机化合物）的普遍低丰度（<1 mg·mL^-1），成为比¹H NMR更适合VHOCs定量表征的方法。而HSQC-NMR（异核单量子相干-核磁共振）虽然灵敏度低于质谱，但仍然是筛选非挥发性化合物（如芳香族化合物和脂肪酸）的宝贵方法，仍然能够有效区分具有高、低和无生物活性的hydrolates。

这项研究的意义在于为入侵藻类的生物技术应用潜力提供了科学依据，同时为最佳采样期和使用有效的分析方法提供了实用建议。通过将生态威胁转化为资源，该研究为可持续的海洋资源利用提供了新思路，特别是在抗菌药物开发领域展示了潜在的应用前景。研究还强调了化学生态学背景下季节性变异的重要性，为未来海洋生物活性物质的开发提供了重要参考。