利用除草剂筛选标记和CO2培养优化技术开发莱茵衣藻工程化异戊二烯生产体系及其废水增值应用研究

《Algal Research》：Engineered isoprene production from Chlamydomonas reinhardtii using herbicide selection markers and CO 2-fed cultivation optimization through multi-parallel photobioreactor headspace gas analysis

本研究针对藻类代谢工程中抗生素抗性基因的环境风险问题，创新性地采用除草剂抗性标记（norflurazon/oxyfluorfen）和实时质谱联用光生物反应器技术，在模式藻类莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）中构建了异戊二烯（isoprene）合成通路。通过表达酵母异戊二烯基二磷酸异构酶（ScIDI）、衣藻自身β-胡萝卜素酮醇酶（CrBKT）和甘薯异戊二烯合酶（IbIspS），结合UV-C诱变筛选，使异戊二烯产量在有机碳培养下达到334 mg/L，并在CO2为唯一碳源的批式培养中优化出33°C/900 μE的最佳条件。进一步利用厌氧膜生物反应器废水进行连续培养，实现日均51 mg/L的异戊二烯产量同步伴随废水脱氮除磷。该研究为藻类生物技术替代抗生素筛选及废水增值转化提供了新范式。

　　

随着全球对可持续生物制造的迫切需求，微藻作为光合微生物因其能够将二氧化碳和无机营养物质转化为高价值生物质而备受关注。然而，藻类代谢工程中长期依赖抗生素抗性基因作为筛选标记，存在水平基因转移的潜在环境风险。此外，传统异戊二烯（橡胶单体和平台化学品）的生产主要依赖化石燃料，开发生物合成路线具有重要战略意义。莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）作为模式光合真核微生物，其核基因组转化技术成熟，但多基因共表达仍面临挑战。

为解决上述问题，研究团队在《Algal Research》发表论文，首次将除草剂抗性标记与多通道光生物反应器-实时质谱联用技术结合，构建了无抗生素抗性基因的莱茵衣藻工程株，实现了以二氧化碳为碳源、废水为营养源的异戊烯同步生产与废水净化。

关键技术方法包括：1）合成生物学手段构建除草剂抗性标记（Norflurazon抗性基因CrPDS^R268T和Oxyfluorfen抗性基因CrPPO^V389M）与异戊二烯合成通路（ScIDI、CrBKT、IbIspS）的融合表达载体；2）UV-C诱变与荧光蛋白报告系统筛选高产株；3）20通道平行光生物反应器耦合实时在线质谱（Hiden Analytical HPR-20）监测异戊烯动态产量；4）厌氧膜生物反应器（AnMBR）废水（含NH₄⁺ 26.1 mg/L、PO₄^3? 3.7 mg/L）作为培养基进行重复批次与恒化器培养。

3.1 莱茵衣藻对除草剂敏感性分析

通过浓度梯度实验确定Norflurazon在固体培养基中2 μM可完全抑制野生型生长，而Oxyfluorfen在0.15 μM下对乙酸碳源培养的藻株抑制效果更显著，为转化子筛选提供基准浓度。

3.2 合成基因标记的转化效率评估

比较10种载体设计发现，携带天然叶绿体靶向肽（CTP）的CrPDS^R268T（质粒3）和CrBKT-CrPPO^V389M融合表达载体（质粒10）转化效率最高（分别为155±1.74和334±1.4转化子/μg DNA），且后者可同步实现酮类胡萝卜素积累（菌落褐变）。

3.3 多基因组合优化提升异戊二烯产量

采用质粒16（IbIspS-RFP-CrPDS^R268T）与质粒13（ScIDI-mTFP-CrBKT-CrPPO^V389M）序贯转化，获得最高产量21 pg/细胞。单独载体表达较融合设计更有效，与既往抗生素筛选结论一致。

3.4 UV-C诱变强化转基因表达

对高产转化子进行30秒UV-C辐照，突变株中异戊二烯产量提升至35 pg/细胞（334 mg/L），SDS-PAGE荧光分析证实ScIDI-mTFP和IbIspS-RFP表达量增加是产量提升主因。

3.5-3.8 CO₂培养条件系统优化

通过35组光强（300-2000 μE）与温度（30-36°C）组合实验，发现33°C/900 μE为批式培养最优条件，异戊二烯挥发速率与培养温度正相关（沸点34°C）。实时质谱监测显示连续光照较光暗循环产量提高172%。

3.9 恒化器模式实现持续生产

在湍动床（turbidostat）模式下维持OD₇₄₀=3.0，连续3天稳定产出51.2±0.7 mg/L/天异戊二烯，证明工程藻在光自养条件下的长期运行潜力。

3.10 废水增值与营养盐去除联产

在AnMBR废水中添加痕量元素可使异戊二烯产量稳定在359-395 ppb，同步实现铵盐（NH₄⁺）和磷酸盐（PO₄^3?）的完全去除，生物质产量（0.8-0.9 g/L）与富培养基相当。

本研究通过除草剂抗性标记替代抗生素，结合高通量培养优化技术，首次在莱茵衣藻中实现了以废水为营养源、CO₂为碳源的异戊二烯光驱合成。所建立的多参数实时监测平台为光合微生物代谢工程提供了技术范本，证明工程微藻在废水增值、二氧化碳固定与特种化学品生产方面的集成应用潜力。尽管当前异戊二烯产率尚未达到商业化要求（约需13,300 L培养液/天产1 L异戊二烯），但该策略为构建“藻类生物精炼厂”提供了概念验证，尤其通过酮类胡萝卜素共积累进一步提升生物质价值。未来需针对特定废水组分优化痕量元素补充策略，并加强转基因藻的生物安全管控研究。