牛滋养层细胞外囊泡调控外周白细胞基因表达谱的免疫调节机制研究

《Animal Reproduction Science》：Bovine trophoblast-derived extracellular vesicles modulate the gene expression profile of peripheral leukocytes

本研究针对妊娠期母胎界面免疫耐受机制，探讨了牛滋养层来源的细胞外囊泡（tEV）对白细胞基因表达及炎症介质分泌的调控作用。通过分离培养妊娠151-209天的牛滋养层细胞并提取tEV，利用纳米颗粒追踪、扫描电镜等技术表征囊泡特性，并利用流式分选的外周血单核细胞（CD8+、CD4+CD25-、CD4+CD25+等亚群）开展体外共培养实验。结果表明tEV可显著上调CD8+细胞IL13、CD4+CD25-细胞IL6等基因表达，并调节CCL4、NCAM1等因子分泌，揭示了tEV通过miRNA/蛋白递送参与母胎免疫微环境调控的新机制，为牛繁殖障碍性疾病提供新视角。

　　

在哺乳动物妊娠过程中，母体免疫系统需要对半同种异体的胎儿表现出特殊的免疫耐受，这一现象被称为"妊娠的免疫悖论"。尽管母体免疫系统能够识别胎儿抗原，但并不会对其发起攻击，反而在母胎界面形成独特的免疫微环境，既能够防御病原体入侵，又能够支持胎儿的生长发育。这种精细的免疫平衡需要胎儿与母体之间复杂的细胞间通讯来维持。近年来，细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）作为一种重要的细胞间通讯媒介，在母胎界面免疫调节中的作用日益受到关注。

细胞外囊泡是脂质双分子层包裹的纳米级颗粒，根据其大小和生物发生机制可分为外泌体（30-200纳米）、微囊泡（100-1000纳米）和凋亡小体（大于1000纳米）。这些囊泡携带蛋白质、核酸、脂质等多种生物活性分子，能够通过递送这些"货物"来调节靶细胞的基因表达和功能。在妊娠过程中，滋养层细胞（胎盘中的胎儿来源细胞）释放的EVs被认为在母胎通讯中发挥关键作用，然而在牛这一重要农业物种中，相关研究仍相对缺乏。

为了填补这一空白，来自美国犹他州立大学兽医学与临床生命科学系的Heloisa M. Rutigliano团队在《Animal Reproduction Science》杂志上发表了他们的最新研究成果。研究人员假设牛滋养层来源的EVs能够调节白细胞基因表达和炎症介质分泌模式，从而参与母胎界面免疫微环境的塑造。

研究团队从妊娠151-209天的牛胎盘组织中分离培养原代滋养层细胞，并通过超速离心法从培养上清中提取EVs（tEV）。利用纳米颗粒追踪分析技术，研究人员发现tEV的浓度达到9.81×10⁸颗粒/毫升，大小分布在25-308纳米之间，大多数颗粒集中在72-134纳米，符合外泌体的特征。扫描电镜进一步确认了EVs的典型杯状形态。

在机制探索方面，研究团队通过小RNA测序和蛋白质组学分析了tEV的货物组成。结果显示，tEV中富含miR-19a、miR-138、miR-362等多种miRNA，这些miRNA的预测靶基因富集在Ras、MAPK、ErbB、Wnt等重要信号通路，涉及细胞增殖、迁移、免疫应答等生物学过程。同时，蛋白质组学鉴定出2814种独特蛋白，包括经典的EV标志物（CD9、CD63、CD81）以及滋养层特异性标志物（PLET1、ANXA1）。

为了评估tEV的免疫调节功能，研究人员从非妊娠奶牛外周血中分离单核细胞，并通过流式细胞术分选出CD8⁺细胞毒性T细胞、CD14⁺单核/巨噬细胞、CD4⁺CD25^-静息T辅助细胞、CD4⁺CD25⁺活化T辅助细胞和TCR-γ/δ⁺细胞等五种白细胞亚群。这些细胞分别与tEV、无EV的滋养层培养上清（nEV）或完整滋养层培养上清（wSP）共培养48小时，随后通过高通量实时荧光定量PCR分析24种免疫相关基因的表达变化。

主要技术方法

研究采用妊娠151-209天的牛胎盘组织分离原代滋养层细胞，通过超速离心提取tEV，利用纳米颗粒追踪分析和扫描电镜表征囊泡特性。从非妊娠奶牛外周血通过密度梯度离心和流式细胞术分选五种白细胞亚群，开展体外共培养实验，通过高通量qPCR分析基因表达，采用蛋白质芯片检测细胞因子分泌。

3.1. 滋养层来源细胞外囊泡的特征

研究显示tEV大小主要集中在72-134纳米，符合外泌体特征。miRNA和蛋白质组学分析揭示了tEV携带的生物活性分子主要参与细胞信号转导和免疫调节通路。

3.2. 滋养层细胞外囊泡诱导的白细胞基因表达变化

在CD8⁺细胞中，tEV显著上调了IL13表达，并显示出增加FOXP3和IL23表达的趋势。在CD4⁺CD25^-细胞中，tEV处理增加了IL6表达，同时降低了IL1B和IL13的表达趋势。CD4⁺CD25⁺细胞在tEV刺激下表现出CXCL8上调以及IL10、IFNG和TNFA表达增加的趋势。γ/δ T细胞在所有处理中均未观察到显著变化。

3.3. 滋养层细胞外囊泡诱导的细胞因子分泌

在蛋白质水平，tEV处理显著增加了CD4⁺细胞中神经细胞粘附分子1（NCAM1）的分泌，并呈现出降低CC趋化因子配体4（CCL4）的趋势。

研究结果表明，牛滋养层来源的EVs能够差异调节不同白细胞亚群的基因表达和细胞因子分泌模式。特别是在CD8⁺T细胞中诱导的FOXP3和IL13上调，提示tEV可能促进这类细胞向调节性表型分化，从而参与母胎界面免疫耐受的建立。同时，tEV对不同细胞因子表达的差异化调控（如同时上调抗炎因子IL10和促炎因子IFNG、TNFA）表明其可能通过平衡促炎和抗炎信号来维持适宜的免疫微环境。

这项研究的创新之处在于首次系统揭示了牛滋养层EVs对多种白细胞亚群的免疫调节作用，为理解反刍动物母胎界面免疫调控机制提供了新视角。研究发现的tEV介导的基因表达变化模式与人类和小鼠研究中的观察相一致，但同时也显示出物种特异性特征。这些发现不仅加深了对牛妊娠免疫生物学的基础理解，也为开发基于EV的生殖健康诊断标志物或治疗策略奠定了基础。未来研究需要进一步探索tEV在体内的功能，以及其在病理妊娠中的变化规律，从而为改善牛繁殖效率提供新策略。