含氨基有机薄膜调控纳米纤维支架先天免疫反应：表面化学与形态对中性粒细胞和巨噬细胞行为的影响

《Applied Materials Today》：Organic films with amino groups on nanofibrous structure control innate immune response

本研究针对合成聚合物纳米纤维支架表面特性不佳、易引发不良免疫反应的问题，开展了含氨基有机薄膜通过等离子体增强化学气相沉积技术修饰聚己内酯纳米纤维的研究。结果表明，高氮含量、正表面电荷及低水稳定性的薄膜会强烈激活中性粒细胞样细胞的促炎反应；而适度降低氮含量可有效减少巨噬细胞样细胞的促炎激活，且纳米纤维的多孔结构有助于增强其促再生特性。该研究为理性设计免疫相容性良好的生物材料提供了重要见解，对组织工程和植入体应用具有重要意义。

　　

在组织工程和再生医学领域，合成聚合物纳米纤维支架，尤其是聚己内酯（PCL），因其能模拟细胞外基质结构而备受青睐。然而，这些材料天然的疏水表面如同一把双刃剑，虽然提供了良好的机械性能，却不利于细胞的黏附与生长，更可能引发机体植入后的不良免疫反应——即无菌性炎症或异物反应。这种复杂的免疫过程涉及中性粒细胞和巨噬细胞等关键免疫细胞的级联活化，若调控不当，可能导致植入失败。因此，如何对材料表面进行“智能化”修饰，使其既能支持组织再生，又能“安抚”机体的免疫系统，成为生物材料设计中的核心挑战之一。

为了解决这一难题，研究人员将目光投向了含有氨基（-NH₂）的有机薄膜。氨基基团在生理条件下可质子化而带正电，易于与带负电的细胞膜和蛋白质发生静电相互作用，从而改善亲水性并促进细胞行为。更为重要的是，相较于传统的湿化学方法，等离子体增强化学气相沉积（PECVD）技术能够在低温下一步完成薄膜沉积，过程高效且环保，尤其适合对温度敏感的高分子材料进行修饰。此前的研究已证实，利用PECVD技术在PCL纳米纤维上沉积含氨基的等离子体聚合物（amine plasma polymers, amine PPs）薄膜，能显著改善成纤维细胞、成肌细胞等多种细胞的活力。但这类修饰表面对免疫细胞，特别是作为免疫反应“先锋部队”的中性粒细胞和“指挥协调员”的巨噬细胞，会产生怎样的影响，尚不明确。这直接关系到植入体最终的命运，是和平共处还是被免疫系统清除。

为了回答这个关键问题，本研究团队开展了一项系统性的体外研究，旨在揭示不同化学特性的含氨基薄膜对先天免疫反应的调控作用。研究创新性地采用了两种重要的免疫细胞模型：人早幼粒白血病细胞HL-60分化而来的中性粒细胞样细胞（dHL-60），用于模拟急性炎症反应；以及人单核细胞白血病细胞THP-1分化而来的巨噬细胞样细胞（dTHP-1），用于模拟异物反应中后期的巨噬细胞响应。研究人员通过调控PECVD过程中的平均射频功率（P_av）为10 W、33 W和150 W，制备了三种氮含量递减的胺类等离子体聚合物薄膜（10 W amine PP, 33 W amine PP, 150 W amine PP），并将其沉积在平坦的组织培养板（TCP）和具有纳米纤维结构的PCL支架上。通过综合运用X射线光电子能谱（XPS）分析表面化学组成，测定表面电势（ζ-电位）和水接触角（WCA）评估物理性质，并结合细胞活力检测、基因表达分析（qPCR）、细胞因子分泌检测（ELISA）、蛋白质印迹（Western blot）、细胞形态观察（SEM、共聚焦显微镜）以及薄膜浸提液实验等多种技术手段，深入探究了表面化学和支架形态对两种免疫细胞行为的精细调控。

研究的关键技术方法主要包括：利用电纺丝技术制备PCL纳米纤维支架；采用PECVD技术在不同功率条件下沉积含氨基有机薄膜；使用XPS和ζ-电位分析对薄膜进行表征；通过体外细胞培养模型（dHL-60和dTHP-1细胞）评估免疫反应，涉及细胞活力（ATP检测）、基因表达（qPCR）、蛋白表达（Western blot, ELISA）和细胞形态学分析（SEM，免疫荧光）等。

3.1. 胺类PPs的表面性质

研究成功制备了三种具有梯度氮含量的胺类PPs薄膜。随着沉积功率从10 W增加至150 W，薄膜中的氮原子百分比从约19.7 at.%降至12.5 at.%（在硅片上测量），而氧含量则因后沉积氧化而增加。相应地，表面ζ-电位从10 W amine PP的+44 mV（强正电性）降至33 W的约0 mV，并在150 W时变为负值（-17 mV）。薄膜的亲水性也随功率变化，10 W制备的薄膜最亲水。此外，低功率（10 W）制备的薄膜交联度较低，在水中的稳定性较差，会释放出可被细胞摄取的荧光浸提物；而高功率（150 W）薄膜则更为稳定。

3.2. 免疫细胞在胺类PPs上的活力

细胞活力实验表明，胺类PPs涂层对免疫细胞活力的影响因细胞类型和基底而异。对于中性粒细胞样dHL-60细胞，在高氮含量的10 W和33 W amine PP涂层上培养24小时后，细胞活力显著降低；而在氮含量最低的150 W amine PP涂层上，活力与未涂层对照相近或略有改善。巨噬细胞样dTHP-1细胞表现出更强的耐受性，在涂层上培养72小时后活力下降幅度较小。值得注意的是，无论是dHL-60还是dTHP-1细胞，在接触胺类PPs后，其细胞裂解物均出现荧光增强，证实细胞摄入了从薄膜中释放的浸提物。

3.3. 中性粒细胞样细胞的免疫反应

基因表达和细胞因子产生分析揭示了dHL-60细胞的反应强烈依赖于表面化学。在高氮含量、正电性的10 W amine PP涂层上，促炎细胞因子基因IL8、CCL2和TNFA的表达以及IL-8蛋白的分泌水平均显著上调，表明发生了强烈的促炎激活。随着氮含量和正电性的降低（33 W，150 W），这种促炎反应逐渐减弱。此外，原本在悬浮状态生长的dHL-60细胞在10 W和33 W amine PP涂层上表现出强烈的黏附特性，且难以被胰蛋白酶消化，这与其激活状态相关。Western blot分析进一步显示，在10 W和33 W涂层上培养2小时后，dHL-60细胞中NF-κB p65亚基的Ser536位点磷酸化水平显著升高，表明经典的促炎信号通路NF-κB被激活。浸提液实验证明，从不稳定的10 W amine PP薄膜中释放的浸提物本身也能诱导dHL-60细胞产生轻微的促炎反应并降低细胞活力。这些结果综合表明，高氨基密度、正电荷表面通过增强细胞黏附，可能触发包括NF-κB通路激活和NETosis（中性粒细胞胞外诱捕网形成）在内的炎症级联反应。

3.4. 巨噬细胞样细胞的免疫反应

巨噬细胞样dTHP-1细胞的反应模式与中性粒细胞相似，但激活阈值有所不同。在平坦的TCP基底上，与未涂层对照相比，氮含量适中的33 W amine PP涂层能显著降低促炎标志物IL1B的基因表达，而150 W涂层的效果因表面可能存在微粒而复杂化。在PCL纳米纤维基底上，33 W和150 W amine PP涂层均能显著降低IL1B的表达。对于促再生（M2型）标志物MRC1的表达，胺类PPs涂层未表现出显著的促进作用，但在PCL纳米纤维上，其表达水平得以维持。细胞形态学分析（SEM）显示，在未涂层和10 W amine PP涂层的PCL纳米纤维上，dTHP-1细胞中呈现圆形、扁平M1型（促炎）形态的比例相对较高；而在33 W和150 W涂层上，M1型比例有所减少，同时呈 elongated M2型（促再生）形态的细胞比例在所有涂层上均有小幅增加，这与基因表达趋势基本一致。浸提液实验表明，胺类PPs的浸提物对dTHP-1细胞的极化方向影响不显著，但会降低细胞活力。特别重要的是，研究观察到PCL纳米纤维的多孔结构本身就有助于改善巨噬细胞的免疫谱，与平坦的TCP相比，能增加促再生M2型细胞因子的表达并降低促炎M1型标志物，这表明基底形态是独立于表面化学的另一个重要免疫调节因素。

本研究得出结论，含氨基有机薄膜的表面化学性质（特别是氮/氨基含量、表面电荷和稳定性）以及基底的形态（平坦 vs. 纳米纤维）共同决定了其对先天免疫反应的调控效果。高氨基密度、正电荷且稳定性较差的薄膜（如10 W amine PP）会强烈激活中性粒细胞，引发显著的促炎反应，不利于生物材料的早期整合。相比之下，适度降低氨基含量和正电性（如33 W，150 W amine PP）的薄膜，特别是当其与具有仿生多孔结构的纳米纤维支架（如PCL NFs）结合时，能够更有效地引导巨噬细胞向促再生表型偏移，同时抑制过度的炎症反应，从而创造出更有利于组织修复的免疫微环境。

该研究的深刻意义在于它强调了在生物材料设计中“免疫知情”的重要性。它证实了通过精确调控表面化学参数和利用仿生结构，可以主动引导宿主的免疫反应向有利于组织再生和植入体整合的方向发展，而非被动地试图抑制免疫。这项发表在《Applied Materials Today》上的工作，不仅为理解胺基化表面对免疫细胞行为的复杂影响提供了详实的实验数据，更重要的是为开发新一代具有免疫调节功能的智能生物材料（如用于伤口愈合、组织工程支架和植入式设备）提供了关键的设计原则和理论依据。未来的研究方向可能包括利用更复杂的共培养模型或体内实验来验证这些体外发现，并探索将这种表面改性策略应用于其他生物材料体系。