非洲疟疾媒介冈比亚按蚊拟除虫菊酯抗性加剧的基因组驱动机制研究

《Molecular Biology and Evolution》：Genomic Drivers of Pyrethroid Resistance Escalation in the Malaria Vector Anopheles funestus Across Africa

本研究针对非洲主要疟疾媒介冈比亚按蚊(Anopheles funestus)对拟除虫菊酯杀虫剂抗性加剧的威胁，通过整合时空转录组、群体基因组和功能验证等多组学方法，揭示了抗性加剧的分子机制。研究发现V-ATPase、微管蛋白α-1和转座酶等新型基因的过度表达，以及表观遗传调控因子(组蛋白H3/H4)的参与。特别重要的是，在细胞色素P450还原酶(CPR)基因中发现N70I突变和5.9 kb启动子区重复，转基因实验证实CPR-70I与P450 CYP6P9a共表达可显著增强拟除虫菊酯抗性。该研究为开发分子标记追踪高抗性蚊媒传播提供了新靶点，对非洲疟疾防控具有重要意义。

　　

在非洲大陆，疟疾仍然是威胁公共健康的重大疾病，而长效杀虫蚊帐(LLINs)是防控疟疾的主要工具。然而，近年来主要疟疾媒介冈比亚按蚊对拟除虫菊酯类杀虫剂的抗性急剧加剧，甚至能够存活10倍诊断浓度(10x DC)的杀虫剂剂量，严重威胁疟疾防控成效。这种"超级抗性"现象的分子机制尚不明确，阻碍了有效抗性管理策略的制定。

在这项发表于《Molecular Biology and Evolution》的研究中，研究人员采用多组学整合分析框架，对2014-2021年间非洲四个地区(喀麦隆、加纳、乌干达和马拉维)的冈比亚按蚊种群进行了时空动态研究。通过RNA测序(RNA-Seq)、群体基因组测序(Pool-Seq)和转基因功能验证等技术，系统揭示了拟除虫菊酯抗性加剧的基因组驱动机制。

关键技术方法

研究团队收集了2014-2021年间非洲四国的野外冈比亚按蚊样本，建立了时空对比样本库。采用RNA-Seq分析基因表达谱变化，Pool-Seq全基因组测序检测遗传变异和选择信号，并通过转基因果蝇模型进行CPR基因突变的功能验证。剂量反应实验使用1X、5X和10X拟除虫菊酯诊断浓度，分析不同抗性水平蚊子的转录组特征。

时空差异表达基因与抗性加剧的关联

研究发现，2014至2021年间，17个基因在四个国家均表现出显著过度表达(FC≥2)。其中V型质子ATP酶亚基B(AFUN019493)表达量增加最为显著，在喀麦隆和马拉维的fold change分别达到35.4和82.2。微管蛋白α-1链(AFUN019762)在加纳和喀麦隆的表达量也增加了20倍以上。

值得注意的是，三个组蛋白相关基因(组蛋白H3、H4和组蛋白赖氨酸N-甲基转移酶)的表达均显著上调，提示表观遗传调控在抗性加剧中发挥作用。此外，转座酶Tcb2(AFUN018596)在加纳和喀麦隆的表达量增加了12-23倍，表明转座元件可能参与抗性演变。

在区域特异性表达模式中，P450基因CYP9K1在喀麦隆的表达量在2021年增加了25倍，而CYP6P4b在喀麦隆和乌干达的表达量也显著上升。特别重要的是，位于2L染色体rp2数量性状基因座(QTL)的CYP6M2基因，在2014年未检测到显著表达，但在2021年的西非、东非和中非地区均成为过度表达最显著的解毒基因之一。

剂量依赖性抗性相关基因鉴定

在马拉维种群的剂量反应实验中，研究人员比较了存活1X、5X和10X拟除虫菊酯剂量蚊子的转录组特征。发现16个基因在所有三个对比中均一致过度表达，包括C型凝集素基因(AFUN006785)和胰蛋白酶基因(AFUN016451)。

两个感官附器蛋白(SAP2和SAP3)基因在所有抗性水平中持续过度表达，其中SAP3在10X剂量下的读计数高达20,794。三个microRNA(mir-14、mir-8和mir-252)和MAPK激酶基因(AFUN005257)的过度表达，提示转录后调控和应激反应通路参与抗性加剧。

群体基因组结构变异分析

PCA分析显示，冈比亚按蚊种群按地理区域聚类，西部(加纳)、中部(喀麦隆)和东部(乌干达)种群遗传距离较近，而南部(马拉维)种群形成独立分支。时间尺度上，2014年和2021年样本呈现明显分化，反映抗性相关的基因组变化。

F_ST分析鉴定出四个与抗性相关的基因组区域：2R染色体的rp1基因座、X染色体的CYP9基因座、3染色体的rdl基因座以及CPR基因区域。其中rp1和CYP9基因座在喀麦隆种群中分化最显著(F_ST~0.35-0.4)。

Tajima's D和核苷酸多样性分析显示，喀麦隆和乌干达种群在CYP9K1基因附近存在强烈选择信号，遗传多样性显著降低，表明阳性选择作用。类似的选择清除信号也在rp1基因座被检测到。

抗性相关基因座的遗传多态性

在CYP6基因座，研究人员发现多个新型单核苷酸多态性(SNP)，包括CYP6P9a(E91D、Y168)、CYP6P9b(V359I、V392F)等。这些突变在中部、东部和西部非洲接近固定，但在南部非洲缺失。

特别重要的是，在CYP9K1基因中发现G454A错义突变，该突变在喀麦隆和乌干达种群中在7年内出现并固定，而在马拉维种群频率较低(25%-29%)。这一突变与拟除虫菊酯抗性直接相关。

CPR基因的结构变异与功能验证

在细胞色素P450还原酶(CPR)基因中，研究发现两个重要变异：在马拉维种群中鉴定的N70I错义突变，以及在加纳种群特异的5.9 kb启动子区重复。N70I突变位于CPR活性位点附近，在马拉维种群中的频率从2009年的0%上升至2021年的80%。

转基因果蝇实验证实，共表达CYP6P9a和突变型CPR-70I的果蝇，对氯菊酯的死亡率(30%)显著低于表达野生型CPR-N70的果蝇(45%，P<0.05)。对α-氯氰菊酯也观察到类似趋势，但对溴氰菊酯无显著差异。

基因组结构变异与抗性演变

研究还发现多个与抗性相关的基因组结构变异。在2R染色体CYP6P9b基因附近鉴定出4.3 kb移动元件插入，在喀麦隆种群中随时间推移而出现。在CYP9K1基因上游也发现类似的较大插入元件。

在CYP6基因座鉴定出7个重复区域，其中两个重复(DUP1和DUP2)在除南部非洲外的所有种群中常见，且频率随时间增加。这些重复可能通过增加基因拷贝数来增强代谢活性。

研究结论与意义

本研究首次在非洲范围内系统揭示了冈比亚按蚊拟除虫菊酯抗性加剧的复杂分子机制。除了已知的P450基因过度表达外，还发现了V-ATPase、微管蛋白、转座酶等新型抗性相关基因，以及表观遗传调控因子的参与。

特别重要的是，CPR基因的N70I突变和启动子区重复的发现，揭示了P450氧化还原伴侣在抗性演变中的关键作用。转基因实验证实了这一机制的功能重要性，为理解代谢抗性的全面机制提供了新视角。

该研究开发的分子标记和鉴定的新型靶基因为非洲疟疾媒介抗性监测提供了重要工具，对制定针对性抗性管理策略、延长现有杀虫剂使用寿命具有重要意义。研究结果强调需要持续基因组监测和开发新型向量控制工具，以应对不断演变的杀虫剂抗性挑战。