塔氏岩芥中新型甲硫氨酸衍生芥子油苷的结构鉴定与系统生物学意义

《Biochemical Systematics and Ecology》：Unusual methionine-derived glucosinolates in Turritis glabra (Brassicaceae) include previously missing side chain lengths as well as 3-oxo and 3-hydroxy derivatives, characterized by NMR and tandem mass spectrometry

本研究针对塔氏岩芥（Turritis glabra）中未被充分认识的甲硫氨酸衍生芥子油苷（Met-derived GSLs）结构多样性问题，通过NMR和串联质谱技术，首次鉴定出4种新型GSLs（78、160、161、162），填补了ω-甲基磺酰烷基侧链长度空白（C6、C7）并发现3-氧代和3-羟基衍生物，为芥子油苷生物合成进化与功能研究提供了关键参考物质和质谱鉴定依据。

　　

在十字花科植物中，芥子油苷（Glucosinolates, GSLs）是一类重要的氨基酸衍生次生代谢物，具有丰富的结构多样性和显著的生物活性。尽管目前已鉴定出91种明确结构的GSLs，但甲硫氨酸衍生（Met-derived）GSLs的完整结构谱系仍存在显著空白，尤其是ω-甲基磺酰烷基（ω-methylsulfonylalkyl）侧链中C5、C6、C7等中间长度链尚未被 conclusive 证实，且3-位（γ-位）氧化修饰（如3-羟基和3-氧代）的GSLs多基于早期水解产物推测而缺乏直接证据。塔氏岩芥（Turritis glabra）作为十字花科中一个较少研究的物种，曾被报道含有长链Met-derived GSLs，但其详细结构特征和多样性尚未系统解析。

为解决上述问题，研究人员对来自丹麦野生种群的塔氏岩芥进行了系统的GSLs分析。通过制备型高效液相色谱分离、酶解脱硫处理后，结合高分辨率质谱（QToF-MS/MS）和多维核磁共振技术（包括COSY、HMBC、ROESY等），首次 conclusive 鉴定了4种新型GSLs：6-(甲基磺酰)己基GSL（78）、7-(甲基磺酰)庚基GSL（160）、3-羟基-7-(甲基磺酰)庚基GSL（161）和6-(甲基磺酰)-3-氧代己基GSL（162）。其中78和160填补了ω-甲基磺酰烷基GSLs侧链长度空白，161和162则首次证实了3-羟基和3-氧代修饰在Met-derived GSLs中的自然存在。

研究还通过DNA条形码（ITS、trnL intron、trnLF）验证了植物材料分类学身份，并建立了可公开获取的种子库（NGB32254），为后续研究提供可靠样本。利用UHPLC-MS/MS对叶片提取物进行 profiling 分析，进一步推测了多种次要GSLs的存在，如5-(甲基磺酰)戊基GSL（[81]）及其衍生物，揭示了塔氏岩芥中GSLs的复杂多样性。

关键技术方法包括：1）野生植物样本的采集与鉴定（丹麦种群，凭证标本CP0014934）；2）GSLs的提取与酶解脱硫（DEAE-Sephadex A25柱与Helix pomatia磺酸酯酶处理）；3）制备型HPLC分离纯化脱硫GSLs；4）多维NMR（¹H, ¹³C, COSY, HMBC, ROESY）与高分辨率质谱（QToF-MS/MS）联用结构解析；5）体外酶解实验（Sinapis alba黑芥子酶）验证GSL核心结构敏感性。

2.1 凭证材料与参考种质的建立

通过形态学和DNA条形码（ITS、trnL、trnLF）鉴定确认野生塔氏岩芥种群，建立种子库NGB32254，确保遗传一致性和样本可重复性。

2.2 脱硫芥子油苷的光谱鉴定

从叶片中分离出多种脱硫GSLs（dGSLs），通过NMR和MS鉴定出主要成分为d78、d160、d161和d162，其中d162显示出独特的UV光谱特征（λ_max 256–257 nm），提示共轭体系改变。

2.3 C6与C7烷基链甲基磺酰基芥子油苷

d78和d160的结构通过NMR确证，分别对应6-(甲基磺酰)己基和7-(甲基磺酰)庚基侧链，MS/MS显示特征碎片（如丢失脱水葡萄糖162 Da），填补了该类GSLs链长空白。

2.4 7-(甲基磺酰)庚基GSL的3-羟基衍生物

d161被鉴定为3-羟基-7-(甲基磺酰)庚基GSL，NMR中C3位化学位移（δ_H 3.56, δ_C 70.1）支持羟基取代，这是首次 conclusive 证实天然Met-derived GSLs中存在3-羟基修饰。

2.5 6-(甲基磺酰)己基GSL的3-氧代衍生物

d162的结构鉴定最具挑战性：NMR显示C3位羰基（δ_C 208.5 ppm），但D₂O中储存后发生H-D交换（增重4 Da），表明酮基α位质子易交换；UV光谱和平衡态环化现象支持其3-氧代结构，MS/MS缺乏侧链特异性碎片但核心结构经黑芥子酶水解验证。

2.6 3-氧代衍生物在氘代水中的H-D交换

d162在D₂O中长期储存后发生半稳定H-D交换（4个位点），¹H NMR中H2和H4信号消失，证实酮基α位活化，为结构推断提供关键佐证。

2.7 羟基与氧代脱硫芥子油苷的MS/MS特征

d161和d162的MS/MS均显示丢失脱水葡萄糖（162 Da），但无特异性侧链碎片，提示3-位修饰不影响核心裂解模式，但增加了鉴定难度。

2.8 天然GSLs的验证与黑芥子酶敏感性

crude 提取物中检测到 intact 78、160、161和162，[M-H]^?离子及HSO₄^?丢失证实结构；黑芥子酶实验显示所有GSLs均被水解，证实其具备典型GSL核心结构（β-硫代葡萄糖苷与硫酸酯）。

2.9 其他相关芥子油苷的LC-MS筛查

profiling 发现推测的[81]（C5同系物）及多种羟基/氧代衍生物异构体，表明塔氏岩芥GSLs存在更复杂的结构多样性，需后续验证。

该研究 conclusive 鉴定了4种新型Met-derived GSLs，不仅填补了ω-甲基磺酰烷基侧链长度空白，还首次证实了3-羟基和3-氧代修饰的自然存在，为GSLs的生物合成进化、化学分类学及生物活性研究提供了关键参考。研究建立的塔氏岩芥种子库和详细光谱数据，将为未来植物代谢组学筛查提供可靠标准，推动十字花科植物资源挖掘与利用。论文发表于《Biochemical Systematics and Ecology》，强调了结构多样性研究在植物系统生物学中的核心价值。