基于结构导向的淋病奈瑟菌甲硫氨酸氨肽酶多表位疫苗的计算机设计

《Biochemistry and Biophysics Reports》：Structure-guided in silico design of a methionine aminopeptidase–derived multi-epitope vaccine candidate against Neisseria gonorrhoeae

本研究针对淋病奈瑟菌日益严峻的抗菌素耐药性问题，采用结构导向的计算机方法，以高度保守的甲硫氨酸氨肽酶(MAP)为靶点，设计多表位疫苗。研究通过AlphaFold2建模、表位预测和分子动力学模拟，筛选出具有强免疫原性、高保守性的B细胞和T细胞表位，为开发广谱淋病疫苗提供了新策略。该疫苗候选物有望克服传统外膜蛋白疫苗的抗原变异难题，具有重要的临床转化前景。

　　

淋病，这一由淋病奈瑟菌(Neisseria gonorrhoeae)引起的性传播疾病，正成为全球公共卫生领域的重大挑战。每年约有8200万新发感染病例，更令人担忧的是，其对抗菌素的耐药性日益增强，使得许多一线治疗方案逐渐失效。然而，人类至今仍未拥有一种获批上市的淋病疫苗。这背后的主要原因在于，淋病奈瑟菌极其“狡猾”，它通过相变异、基因重组和水平基因转移等方式，使其表面的抗原（如外膜蛋白PorB、AniA等）高度可变，犹如不断更换的“伪装”，从而轻松逃避免疫系统的识别和攻击。以往针对这些易变抗原的疫苗研发努力，常常因病毒株特异性太强、保护范围窄而折戟沉沙。因此，科学家们开始转变思路，将目光投向细菌内部那些为生存所必需、因而在进化上高度保守的蛋白质，希望从中找到能够激发广泛且持久免疫力的理想疫苗靶点。

正是在这一背景下，本研究聚焦于一种名为甲硫氨酸氨肽酶(Methionine Aminopeptidase, MAP)的关键酶。MAP是一种金属酶，负责在细菌蛋白质合成后切除起始的甲硫氨酸，这个过程对于细菌的正确成熟和功能至关重要。由于其功能不可或缺，MAP的序列和结构在不同菌株乃至不同细菌物种间都表现出惊人的保守性，这意味着它不容易发生突变，是规避抗原变异问题的理想靶标。此前在结核分枝杆菌和肺炎链球菌中的研究已经表明，以其MAP同源物为基础的疫苗能够引发保护性免疫。那么，淋病奈瑟菌的MAP是否也能成为一把对抗淋病的“万能钥匙”呢？为了回答这个问题，研究人员开展了一项深入的计算机模拟研究，相关成果发表在《Biochemistry and Biophysics Reports》上。

为了验证这一设想，研究人员采用了一系列先进的生物信息学和计算生物学技术。首先，他们从UniProt数据库获取了淋病奈瑟菌MAP的参考序列，并利用AlphaFold2人工智能系统高精度地预测了其三维结构。随后，他们综合运用BepiPred-3.0、ABCpred、DiscoTope-3.0等工具预测了MAP蛋白上潜在的B细胞表位（即能被抗体识别的区域），同时使用NetMHCpan 4.1b和NetMHCIIpan 4.0预测了能分别被CD8⁺和CD4⁺ T细胞识别的表位。所有的预测都严格避开了酶的催化活性中心，以确保未来的疫苗不会影响细菌的正常生理功能从而产生过强的选择压力。为了评估这些表位的广谱潜力，研究人员分析了从2007年至2022年间收集的48株临床淋病奈瑟菌分离株的MAP基因序列，以确认其保守性。此外，还通过BLASTp比对人类蛋白质组来排除可能引发自身免疫反应的风险，并利用SOLpro评估了MAP蛋白的可溶性（ manufacturability）。最后，针对筛选出的关键表位与特定人类白细胞抗原（HLA，即MHC在人类中的对应物）形成的复合物，研究人员进行了分子对接和长达100纳秒的分子动力学模拟，以评估其结合的稳定性。用于分析的48株临床菌株基因组数据来源于公共基因组数据库。

3.1. 结构保守的甲硫氨酸氨肽酶

通过AlphaFold2建模，研究人员成功获得了淋病奈瑟菌MAP的高置信度三维结构模型。该模型呈现出典型的肽酶M24折叠方式，是一个单体酶。其催化口袋由H82、D110、H173、D206和E237这五个保守残基构成，用于结合二价金属离子。模型整体平均置信度很高，表面的环状区域结构可靠。研究特意避开了催化中心15埃范围内的区域，将免疫原性分析的焦点集中在表面可及的非催化环上，这些区域显示出良好的可接触性，具备成为稳定抗原表位的潜力。

3.2. 跨全球分离株的系统发育保守性

对48株来自不同地区、不同年份的临床分离株的MAP序列进行分析后发现，这些序列与参考序列的差异极小，分支长度非常短。绝大多数菌株的MAP序列与参考序列完全一致，仅有少数菌株显示出微小的多态性。这极好地证明了MAP在淋病奈瑟菌全球不同谱系中具有非凡的进化稳定性，为其作为广谱疫苗靶点的可行性提供了坚实依据。

3.3. 表位保守性和安全性分析

所有筛选出的主要表位，包括CD8⁺ T细胞表位SMSDCAVAV (结合HLA-A*02:01)、CD4⁺ T细胞表位YTAVRQTAAHCLDAG (结合HLA-DRB1 * 07:01)以及构象性B细胞表位EC1 (66-75位氨基酸)，在所有分析的48株菌株中均100%保守。与人类蛋白质组的比对显示，这些表位与人类蛋白的相似性低于30%，自身免疫风险低。MAP蛋白本身 predicted 溶解性很高，便于后续生产和纯化。

3.4. MAP同源物的结构聚类提示进化上不同的亚群

通过比较MAP同源蛋白的序列特征，研究人员发现淋病奈瑟菌的MAP位于最保守的聚类中，这表明其结构与相近的细菌MAP具有共享的祖先和交叉结构兼容性，进一步支持了其结构的保守性。

3.5. 用于结构建模的MAP同源物筛选

研究人员对通过同源搜索找到的大量MAP同源序列进行了严格筛选和去冗余，最终获得了一个包含150个非冗余同源物的数据集，这些同源物涵盖了广泛的细菌种类，为后续的保守性分析和结构比较提供了高质量的基础。

3.6. 线性和构象B细胞表位预测

使用BepiPred-3.0和ABCpred工具预测线性B细胞表位，发现了三个主要的抗原区域。DiscoTope-3.0工具则用于预测构象性B细胞表位（由蛋白质三维空间中不相邻的氨基酸残基构成），其中表位簇EC1和EC2显示出较高的表面可及性和免疫原性预测得分。这些B细胞表位区域与催化中心保持安全距离。

3.7. T细胞表位预测（MHC-II和MHC-I）

对于T细胞免疫，研究人员预测了能结合常见HLA类型的表位。其中，CD8⁺ T细胞表位SMSDCAVAV (HLA-A*02:01)显示了极强的结合亲和力预测值，并且其诱导干扰素-γ(IFN-γ)的潜力也很高。CD4⁺ T细胞表位YTAVRQTAAHCLDAG (HLA-DRB1 * 07:01)同样表现出强结合力，并且有趣的是，它与一个预测的B细胞表位区域有重叠，这暗示了可能引发协同的体液和细胞免疫反应。

3.8. 淋病奈瑟菌MAP蛋白中优先考虑的MHC-II表位

对MHC-II表位的深入分析确认了YTAVRQTAAHCLDAG作为核心候选表位，其具有高保守性、表面可及性，并且与另一个CD8⁺ T细胞表位在空间上接近，有利于免疫应答的联动。

3.9. 与IEDB数据库的预测表位交叉验证

将本研究预测的所有表位与免疫表位数据库(IEDB)进行比对，未发现完全相同的记录，表明这些是淋病奈瑟菌MAP中未被报道过的新表位，突出了本研究的创新性。

3.10. MAP模型的结构验证

通过各种生物信息学工具（如Verify3D, PROCHECK）对AlphaFold2预测的MAP模型进行质量评估，结果显示模型整体立体化学质量良好，尽管N端等局部区域存在一定柔性，但核心区域特别是表位所在区域结构合理可靠。

3.11. 表位对抗免疫逃逸的稳定性

评估显示，筛选出的主要T细胞表位不易被糖基化屏蔽，对蛋白酶降解也具有较强的抵抗力，且其编码基因区域没有发现可能导致相变异的简单序列重复，这表明它们能够稳定地呈递给免疫系统。

3.12. 物理化学性质、抗原性和毒性筛选

主要表位的物理化学性质分析表明它们适合用于疫苗设计，抗原性预测得分高，且没有预测的毒性或过敏性风险。

3.13. 分子对接模拟

对关键的CD4⁺ T细胞表位YTAVRQTAAHCLDAG与其对应的HLA分子（HLA-DRB1 * 07:01）的复合物进行了分子对接和100纳秒的分子动力学模拟。模拟结果显示，该复合物结构稳定，肽段的核心锚定残基与HLA分子的结合口袋形成了持久的作用力，肽段的两端虽有一定柔性但整体结合模式稳定，这从理论上支持了该表位能够被有效呈递并激活T细胞。

综上所述，本研究通过系统的计算机模拟分析，有力地论证了甲硫氨酸氨肽酶(MAP)作为抗淋病奈瑟菌新型疫苗靶点的巨大潜力。其核心优势在于：靶点高度保守，可避免抗原变异问题；筛选出的B细胞和T细胞表位免疫原性强且安全性高；表位空间分布有利于激发协同免疫应答；蛋白本身具有良好的可溶性，便于生产。这些发现为后续的实验验证和疫苗开发奠定了坚实的理论基础，指明了一条克服淋病疫苗研发瓶颈的新途径。当然，这些优秀的计算机预测结果最终需要通过体外结合实验、动物模型免疫原性和保护效力试验等来进一步证实。如果成功，基于MAP的多表位疫苗有望成为一种能够应对多种淋病奈瑟菌菌株的广谱疫苗，为控制这一顽固的传染病带来新的希望。