基于LC-MS/MS的血清硫酸吲哚酚定量检测方法开发及其在慢性肾脏病评估中的标准化研究

《Biochemistry and Biophysics Reports》：Clinical Quantitative Method Development of serum indoxyl sulfate (IS) assay using LC-MS/MS

本研究针对慢性肾脏病(CKD)重要生物标志物硫酸吲哚酚(IS)缺乏标准化检测方法的问题，开发了基于液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)的血清IS定量检测方法。研究通过系统验证显示该方法线性良好(R2=0.9995)，精密度高(CV 2.6-9.2%)，与酶法检测高度相关(R=0.996)，且抗干扰能力强。该方法有望成为IS检测的参考方法，推动CKD诊疗标准化。

　　

在当今全球人口老龄化加剧的背景下，慢性肾脏病（CKD）已成为威胁公共健康的重要问题，据统计影响全球8-16%的人口。作为一种常见的尿毒症毒素，硫酸吲哚酚（IS）是色氨酸的代谢终产物，在肾功能正常时通过尿液排出体外。然而，当肾功能受损时，IS在血液中积聚，不仅会促进肾脏纤维化和炎症反应，还与主动脉钙化、血管硬化和心肌病变等多种并发症密切相关。因此，准确量化IS浓度对于CKD的病程监测、分期评估以及血液透析时机的确定都具有重要意义。

尽管目前市场上有多个公司提供IS检测试剂，但由于缺乏标准化的检测方法，这些试剂仅限研究使用，尚未获得临床诊断应用的批准。酶法分析虽然常见且实用，但不同方法间存在差异，难以实现标准化。为了解决这一问题，来自日本国际医疗福祉大学成田保健科学系的Sohei Kobayashi等研究人员开展了一项开创性研究，旨在建立一种基于液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）的血清IS标准化检测方法，并对该方法进行全面性能验证。该研究发表在《Biochemistry and Biophysics Reports》期刊上。

研究人员采用AB SCIEX QTRAP? 4500 LC-MS/MS系统，以3-吲哚酚-d4硫酸钾盐(IS-d4)作为内标，建立了血清IS的定量分析方法。研究使用的血清样本来自千叶大学医院已签署知情同意书的肾病患者。方法验证严格遵循临床和实验室标准协会(CLSI)和国际标准化组织(ISO)的相关指南，重点评估了线性、精密度、选择性、干扰物影响、空白限(LOB)、检测限(LOD)和定量下限(LLOQ)等关键性能指标，并与传统酶法进行了相关性比较。

3.2.1. 线性评价

通过标准溶液和患者血清样本的稀释实验验证方法的线性范围。结果显示，在高达440 μmol/L的浓度范围内，标准溶液和患者血清样本均显示出良好的线性关系，且直线通过原点，决定系数R²达到0.9995。考虑到CKD患者IS浓度范围和临床决策需求，这一线性范围完全满足实际应用要求。

3.2.2. 精密度测试

重复性测试显示，在8.3-124.6 μmol/L浓度范围内，变异系数(CV)为2.6-4.7%。中间精密度测试显示，在12.9-171.2 μmol/L浓度范围内，CV为7.9-9.2%。两位检测者之间的组内相关系数(ICC)达到0.999，表明方法具有极好的稳定性和操作者间一致性。

3.2.3. 相关性评价

将LC-MS/MS方法(y)与常规酶法(x)进行对比，结果显示两者高度相关，相关系数R=0.996，回归方程为y=1.13x-2.89。这表明LC-MS/MS方法与现有常规方法具有良好的一致性，且无显著偏差。

3.2.4. 选择性测试

使用5%人血清白蛋白(HAS)溶液和血清进行选择性评估，回收率为101.0-104.3%。基质因子评估显示回收率为100.6-105.7%，所有CV均小于1.5%。生理盐水样本中未检测到IS，证明方法具有良好的选择性。

3.2.5. 干扰物影响测试

评估了胆红素F(F-Bil)、胆红素C(C-Bil)、血红蛋白(Hb)和乳糜等常见干扰物的影响。结果显示，最大干扰率约为5.0%，其中F-Bil的干扰最为明显(4.7-5.4%)，而血红蛋白的干扰最小(0.0-0.1%)。所有干扰物的影响均在可接受范围内。

3.2.6. 空白限(LOB)、检测限(LOD)和定量下限(LLOQ)评估

LOB为0.004 μmol/L，LOD为1.248 μmol/L。LLOQ评估显示，在CV为20%时，最低定量浓度为3.23 μmol/L，满足临床检测的灵敏度要求。

本研究成功建立了基于LC-MS/MS的血清IS定量检测方法，并进行了全面系统的方法学验证。结果表明，该方法线性范围宽、精密度高、抗干扰能力强，与常规酶法高度相关，检测灵敏度满足临床需求。特别值得关注的是，两位独立检测者获得的结果高度一致，证明该方法具有很好的稳定性和可重复性。

该研究的创新性在于对IS标准测量方法进行了比以往报道更为全面的性能验证，为IS检测的标准化提供了可靠的技术支持。使用稳定的同位素标记内标IS-d4有效校正了前处理和分析过程中的变异，提高了定量的准确性。优化的色谱条件使用含0.1%甲酸的纯水(流动相A)和含0.1%甲酸的乙腈(流动相B)，实现了IS的良好分离，保留时间约为1.2分钟。

随着临床检验标准化需求的不断增加，参考物质和参考测量程序的建立变得尤为重要。本研究建立的LC-MS/MS方法使用IS-d4作为内标，具有干扰小、灵敏度高、重复性好的特点，有望成为IS检测的参考方法，推动CKD相关生物标志物检测的标准化进程，为CKD的精准诊断和治疗监测提供技术支持。未来，这一方法的推广应用将有助于提高不同实验室间IS检测结果的可比性，促进CKD诊疗的规范化。