赖氨酸修饰增强核桃花黑色素功能特性：结构表征、稳定性及生物活性研究

本研究针对核桃花资源浪费和天然黑色素应用受限问题，通过超声辅助碱提酸沉法优化核桃花黑色素（WFM）提取工艺，并首次采用赖氨酸（Lysine）对其进行化学修饰。结果表明，赖氨酸修饰显著提升了WFM的色价、溶解性、稳定性（热/光/pH）及生物活性（抗氧化、抗菌），为核桃花高值化利用和多功能天然色素开发提供了新策略。

　　

在食品工业追求清洁标签和天然添加剂的时代，黑色素作为一种广泛存在于生物体中的天然色素，因其独特的着色能力和多种生物活性（如抗氧化、抗菌等）而备受关注。然而，天然黑色素存在溶解性差（仅溶于碱性环境）、在酸性条件下易沉淀、功能特性不稳定等问题，极大地限制了其在食品、医药等领域的应用。同时，农业加工副产物的高值化利用是可持续发展的重要课题。核桃（Juglans regia L.）作为重要的经济作物，其花朵常被作为农业废弃物丢弃，造成资源浪费。研究表明，核桃花富含蛋白质、多酚和黑色素等生物活性物质，具有开发为功能性食品配料和天然色素的潜力。但目前关于核桃花黑色素（Walnut Flower Melanin, WFM）的提取及其功能改良的研究尚属空白。

为了填补这一知识空白，并促进核桃花资源的增值利用，山西农业大学食品科学与工程学院的研究团队在《Food Chemistry: X》上发表了题为"Functional property enhancement of walnut flower melanin by lysine modification: Structural characterization, stability, and bioactivity studies"的研究论文。该研究旨在通过优化WFM的提取工艺，并利用赖氨酸对其进行修饰，以期改善其理化性质和功能活性，为核桃花黑色素的开发应用提供理论依据和技术支持。

为开展本研究，研究人员主要应用了以下几项关键技术方法：首先，采用超声辅助碱提酸沉法从核桃花中提取WFM，并通过单因素实验和响应面法（Box-Behnken设计）优化提取工艺参数（如NaOH浓度、超声功率、时间、温度、料液比）。其次，通过溶解度测定筛选出赖氨酸作为最佳修饰氨基酸，并优化了WFM与赖氨酸的最佳修饰比例。随后，利用多种表征技术对修饰前后的WFM（即L-WFM）进行系统分析，包括紫外-可见光谱（UV-Vis）、傅里叶变换红外光谱（FTIR）、X射线衍射（XRD）、同步热分析（TG-DSC）、X射线光电子能谱（XPS）、扫描电子显微镜（SEM）和元素分析（EA）。最后，系统评估了WFM和L-WFM的色价、在不同溶剂中的溶解度、在不同温度、光照和pH条件下的稳定性，以及体外抗氧化能力（DPPH、ABTS、羟基自由基清除率和还原力测定）和抗菌活性（针对大肠杆菌Escherichia coli和金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus的抑菌圈法）。

3.1. WFM最佳提取条件的优化

通过单因素实验和响应面优化，确定了WFM的最佳提取条件为：NaOH浓度0.80 mol/L，超声功率82 W，超声时间60 min，料液比1:25，超声温度75 °C。在此条件下，WFM的提取率可达16.13%。响应面分析表明，各因素对提取率的影响顺序为超声温度 > NaOH浓度 > 超声功率。

3.2. WFM修饰用氨基酸的筛选与分析

通过比较八种不同氨基酸修饰后WFM溶液的吸光度（500 nm），发现赖氨酸（Lysine）修饰的WFM（L-WFM）吸光度显著高于其他氨基酸组，表明赖氨酸能最有效地改善WFM的溶解度，因此被选为最佳修饰氨基酸。

3.3. 赖氨酸-WFM修饰浓度的分析

通过考察不同WFM:赖氨酸质量比（1:0.5至1:3）下L-WFM的吸光度，发现当比例为1:2.5时，吸光度达到最大值（0.70），表明此比例为最佳修饰条件。

3.4. WFM和L-WFM的表征分析

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  3.4.1. UV-Vis光谱分析：与WFM相比，L-WFM的最大吸收波长（λ_max）发生了约3 nm的蓝移（从206.11 nm移至203.03 nm），表明赖氨酸的引入改变了黑色素的共轭体系或分子聚集状态。
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  3.4.2. FTIR红外光谱分析：L-WFM在3405 cm^-1、2935 cm^-1和1631 cm^-1等处的吸收峰发生红移，并在1402 cm^-1处出现新峰，归因于赖氨酸的氨基（-NH₂）与WFM中的酚羟基（-OH）、羧基（-COOH）等基团发生了相互作用，证明了修饰的成功。
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  3.4.3. X射线衍射分析：WFM和L-WFM均呈现典型的非晶态特征，表明赖氨酸修饰未改变其无定形结构。
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  3.4.4. 热稳定性分析：TG-DSC结果显示，L-WFM在100-800 °C的热分解阶段失重率（67.81%）高于WFM（56.89%），且其吸热峰和放热峰均发生蓝移，表明赖氨酸修饰降低了WFM的热稳定性，可能是由于新引入的化学键较弱，破坏了分子间原有的紧密堆积。
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  3.4.5. X射线光电子能谱分析：WFM和L-WFM的C 1s、N 1s、O 1s谱图结合能位置相似，但峰强度存在差异，提示表面化学组成和官能团含量无显著差异，但存在相互作用。
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  3.4.6. 扫描电子显微镜观察分析：WFM呈不规则块状团聚体，表面粗糙；而L-WFM则转变为光滑的片状晶体形态，无样品间粘连，表明修饰改变了其微观形貌。
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  3.4.7. 元素分析：WFM的氮（N）含量为6.643%，属于褐黑色素（pheomelanin）；L-WFM的N含量显著升高至9.635%，进入真黑色素（eumelanin）范围。同时，L-WFM的C/H和C/N比值降低，表明赖氨酸的引入增加了氮含量并降低了芳香性。

3.5. 色价分析

L-WFM的色价（E^1%_1cm = 672.14 U·g^-1）显著高于WFM（346.27 U·g^-1），表明修饰后其着色能力增强。

3.6. 溶解度分析

WFM仅溶于NaOH溶液，而L-WFM可溶于NaOH溶液和蒸馏水，在HCl中微溶，两者均不溶于有机溶剂。赖氨酸修饰显著改善了WFM在水和酸性环境中的溶解性。

3.7. 稳定性分析

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  3.7.1. 温度稳定性：随温度升高和时间延长，WFM和L-WFM的吸光度均下降，但L-WFM的吸光度下降幅度远小于WFM，表明其热稳定性得到改善。
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  3.7.2. 光稳定性：在自然光、避光和紫外光照射下，WFM和L-WFM的吸光度均随时间延长而下降，紫外光下降最明显。L-WFM在不同光照条件下的稳定性均优于WFM。
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  3.7.3. pH稳定性：在pH 2-11范围内，WFM和L-WFM的吸光度随pH升高而增加。L-WFM在酸性条件下的溶解度和稳定性显著优于WFM。

3.8. 体外抗氧化活性分析

在DPPH自由基、ABTS自由基、羟基自由基清除实验以及还原力测定中，WFM和L-WFM的抗氧化活性均呈浓度依赖性增强。在相同浓度下，L-WFM的抗氧化能力显著强于WFM。

3.9. 体外抗菌活性分析

WFM和L-WFM对革兰氏阴性菌（E. coli）和革兰氏阳性菌（S. aureus）均具有抑制作用。L-WFM的抑菌圈直径显著大于WFM，表明其抗菌活性更强。

综上所述，本研究首次采用超声辅助碱提酸沉法从核桃花中高效提取黑色素（WFM），并成功利用赖氨酸对其进行化学修饰，制备出L-WFM。研究系统地表征了修饰前后黑色素的结构变化，证实赖氨酸修饰引起了WFM紫外吸收蓝移、微观形貌由不规则团聚体转变为光滑片状晶体、热稳定性降低但色价显著提高。更重要的是，赖氨酸修饰极大地改善了WFM的溶解性（特别是在水和酸性环境中）以及在不同温度、光照和pH条件下的稳定性。此外，L-WFM的体外抗氧化活性和抗菌活性也得到显著增强。元素分析显示，修饰后L-WFM的氮含量增加，使其从褐黑色素特性转向真黑色素特性。

该研究的成功不仅为核桃花这一农业副产物的高值化利用提供了新途径，而且通过氨基酸修饰策略有效克服了天然黑色素在实际应用中的关键限制（溶解性差、稳定性不佳），开发出一种具有优异水溶性、稳定性和增强生物活性的新型天然色素。L-WFM作为一种多功能食品配料，在功能性食品、化妆品和生物材料等领域具有广阔的应用前景，符合当前清洁标签和可持续发展的需求。本研究为天然色素的功能化改性提供了重要的理论依据和技术范例。