白藜芦醇及其糖基化与酰化衍生物的结构-活性关系及其对α-葡萄糖苷酶的抑制机制研究

《Food Chemistry》：Investigation of the structure-activity relationship of resveratrol and its glycosylated and acylated derivatives in relation to their α-glucosidase inhibitory activities

本研究针对天然产物白藜芦醇及其衍生物对α-葡萄糖苷酶(α-glucosidase)的抑制活性与机制展开深入探索。研究人员系统比较了白藜芦醇、其C-4′位糖基化及后续没食子酰化衍生物的抑制效能，揭示了C-4′糖基化显著增强抑制活性，而C-6′′位酰化因空间位阻较小，其抑制效果优于C-2′′位酰化。结合酶动力学、多维光谱学、分子对接与分子动力学模拟，阐明了衍生物通过增加氢键数量和更深入结合口袋，以疏水作用和氢键为主导力，诱导酶构象变化，从而稳定结合并增强抑制的分子机制。该研究为开发高效、低毒的抗糖尿病功能性食品成分提供了理论依据。

　　

随着全球糖尿病发病率的持续攀升，尤其是2型糖尿病在青少年群体中的流行，寻找安全有效的血糖控制策略已成为公共卫生领域的重大挑战。α-葡萄糖苷酶抑制剂，如阿卡波糖(acarbose)，是控制餐后血糖的常用药物，但长期使用可能伴随肝功能损害、乳酸酸中毒、胃肠道不适甚至低血糖等不良反应。因此，从天然产物中发掘高效低毒的α-葡萄糖苷酶抑制剂成为了研究热点。白藜芦醇(Resveratrol)作为一种广泛存在于葡萄、蓝莓等植物中的多酚类化合物，虽已显示出良好的α-葡萄糖苷酶抑制活性，但其结构修饰如何影响其抑制效能及作用机制，尤其是糖基化(Glycosylation)和酰化(Acylation)这两种常见修饰的具体贡献，尚缺乏系统深入的研究。为了解决这一问题，发表在《Food Chemistry》上的这项研究，对白藜芦醇及其糖基化、酰化衍生物与α-葡萄糖苷酶的相互作用进行了多层次的精细解析。

为开展此项研究，作者团队主要运用了以下几项关键技术：酶抑制动力学分析以确定抑制类型和强度；稳态、同步和三维荧光光谱以及圆二色光谱(CD)用于分析酶构象和微环境变化；计算机辅助虚拟分析，包括分子对接(Molecular Docking)预测结合模式和分子动力学模拟(Molecular Dynamics Simulations)评估复合物稳定性。

3.1. Compound identification

研究人员首先通过核磁共振(NMR)谱图确认了从药用植物掌叶大黄中分离得到的两个酰化衍生物——白藜芦醇 4’-O-(6′′-O-没食子酰)-葡萄糖苷和白藜芦醇 4’-O-(2′′-O-没食子酰)-葡萄糖苷的结构。

3.2. Inhibitory effect of resveratrol and its glycosylation and acylation derivatives on α-glucosidase

酶抑制实验结果显示，所有化合物均呈现浓度依赖性抑制。其半抑制浓度(IC₅₀)从大到小依次为：白藜芦醇 > 白藜芦醇-4’-O-葡萄糖苷 > 白藜芦醇 4’-O-(2′′-O-没食子酰)-葡萄糖苷 > 白藜芦醇 4’-O-(6′′-O-没食子酰)-葡萄糖苷，且均优于阳性药阿卡波糖。这表明C-4′位的糖基化能显著增强抑制活性，而后续的没食子酰化能进一步提升活性，且C-6′′位酰化因空间位阻较小，其效果略优于C-2′′位酰化。

3.3. Inhibition type of resveratrol and its glycosylation and acylation derivatives on α-glucosidase

酶动力学分析表明，白藜芦醇-4’-O-葡萄糖苷表现为竞争性抑制，而白藜芦醇及其两个酰化衍生物则表现为非竞争性抑制。抑制常数(K_ic, K_iu)的计算结果与抑制类型相符，并进一步证实了酰化衍生物具有更高的亲和力。

3.4. Fluorescence quenching mechanism of resveratrol and its glycosylation and acylation derivatives on α-glucosidase

荧光猝灭实验表明，化合物与α-葡萄糖苷酶的结合导致酶的内源荧光发生浓度依赖性的猝灭，并伴有蓝移。Stern-Volmer方程分析证实其为静态猝灭机制，且猝灭常数(K_sv)随温度升高而增大，提示疏水相互作用是主要作用力之一。

3.5. Binding sites and affinity constants

通过Scatchard方程计算结合常数(K_a)和结合位点数(n)，发现结合强度顺序与抑制活性顺序一致（化合物3 > 化合物4 > 化合物2 > 化合物1），且n值接近1，表明均为单一位点结合。

3.6. Binding affinity and thermodynamic parameters

热力学参数分析显示，结合过程的吉布斯自由能变(ΔG)为负值，焓变(ΔH)和熵变(ΔS)均为正值，表明结合是自发、吸热、熵驱动的过程，主要作用力为疏水作用，同时氢键作用也不可忽视。

3.7. Synchronous fluorescence spectroscopy

同步荧光光谱显示，化合物结合导致酪氨酸(Tyr)和色氨酸(Trp)残基的荧光强度降低和微环境改变，表明白藜芦醇及其衍生物的结合诱导了酶构象变化，使其疏水区域更暴露于溶剂。

3.8. Three-dimensional fluorescence spectral analysis

三维荧光光谱进一步证实了化合物结合引起了α-葡萄糖苷酶肽骨架结构和Trp/Tyr残基微环境的显著改变，荧光猝灭程度与结合常数和抑制活性顺序一致。

3.9. CD analysis

圆二色光谱分析表明，化合物结合引起了α-葡萄糖苷酶二级结构含量的变化，表明白藜芦醇衍生物的结合确实诱导了酶构象的重排。

3.10. Computer-aided virtual analysis

分子对接显示，糖基化和酰化修饰增加了化合物与α-葡萄糖苷酶氨基酸残基间的氢键和疏水相互作用数量，降低了结合能，从而增强了结合稳定性和抑制活性，结合能顺序与实验测定抑制活性顺序吻合。分子动力学模拟的RMSD（均方根偏差）、RMSF（均方根涨落）、Rg（回转半径）、SASA（溶剂可及表面积）和氢键数量分析均表明，酰化衍生物（尤其是化合物3）与酶形成的复合物更稳定。MMPBSA（分子力学泊松-玻尔兹曼表面积法）计算得到的结合自由能也支持这一结论。

综上所述，本研究通过多技术联用，系统阐明了白藜芦醇C-4′位糖基化及其后续没食子酰化修饰对其α-葡萄糖苷酶抑制活性的增强作用及分子机制。研究证实，糖基化引入了额外的氢键，而酰化进一步增加了相互作用，特别是C-6′′位酰化因空间位阻更小，能更深地嵌入酶活性口袋，形成更稳定的复合物。结合过程主要由疏水作用和氢键驱动，并伴随酶构象变化。该研究不仅深化了对白藜芦醇衍生物构效关系的理解，而且为基于天然产物结构优化、设计高效低毒的α-葡萄糖苷酶抑制剂用于糖尿病防治和功能性食品开发提供了重要的理论依据和设计思路。值得注意的是，本研究聚焦于C-4′位的修饰，而C-3或C-5位类似修饰的构效关系仍有待未来探索。