qPCR-PMAxx?与ddPCR-PMAxx?技术定量检测不锈钢表面干燥及消毒后阪崎克罗诺杆菌VBNC状态的开发与应用

本文开发了qPCR-PMAxx?和ddPCR-PMAxx?方法，用于定量检测不锈钢表面经干燥和商业消毒剂处理后仍存活的阪崎克罗诺杆菌（Cronobacter sakazakii）的VBNC（可存活但不可培养）状态。研究发现qPCR-PMAxx?能有效区分活菌与死菌，揭示VBNC细胞约占存活菌总数的1/100，为食品加工环境中的隐匿污染源监测提供了新策略。

　　

Highlight

亮点聚焦

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  首次开发针对不锈钢表面VBNC阪崎克罗诺杆菌的定量检测系统
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  qPCR-PMAxx?在VBNC检测中优于ddPCR-PMAxx?
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  58°C干燥和过氧乙酸处理可诱导VBNC状态形成

Introduction

引言

阪崎克罗诺杆菌（Cronobacter spp.）是一种革兰氏阴性杆菌，可引发新生儿脑膜炎和坏死性小肠结肠炎等致命感染。该菌在乳粉生产环境中表现出极强的持久存活能力，可能与其进入VBNC（可存活但不可培养）状态有关。本研究旨在开发表面采样下的VBNC检测技术，揭示其在工业胁迫下的存活机制。

Section snippets

章节摘要

Bacterial cultures and DNA extraction

细菌培养与DNA提取

实验菌株（表S1）于-80°C甘油保存，使用胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）培养。基因组DNA通过QIAGEN DNeasy试剂盒从离心菌沉淀中提取。

In silico specificity validation of probe sequence

探针序列的计算机特异性验证

基于rpoB基因设计的引物探针系统对阪崎克罗诺杆菌属呈现100%覆盖度，但可能交叉检测近缘菌种（如Citrobacter spp.）。单拷贝的rpoB基因保障了定量可靠性。

Discussion

讨论

本研究设计的引物系统虽存在近缘菌交叉风险，但适用于目标环境监测。qPCR-PMAxx?在区分活/死细胞时表现更稳定，而ddPCR虽灵敏度高却易受PMAxx?渗透性影响。干燥（58°C, 20%湿度）48小时后可培养菌下降4.24 log，而VBNC细胞占比达1%，证实该状态是菌体在胁迫下的重要存活策略。

CRediT authorship contribution statement

作者贡献声明

Romain Delattre：原始撰写、数据分析；Brice Bargoumane：数据整理；Karine Le Barillec：经费支持与督导；Simon Le Hello：综述修订与概念验证；Aurélie Hanin：项目统筹与实验设计。

Uncited reference

未引用文献

European Commission. Joint Research Centre, 2019.

Declaration of Competing Interest

利益冲突声明

作者声明无利益冲突。

Acknowledgements

致谢

研究受法国国家研究机构（ANRT）和乳制品行业协会资助，感谢乳企提供的生产环境数据支持。