过氧化氢诱导EHEC O157:H7氧化应激反应的转录组与蛋白质组学整合分析

《Heliyon》：Transcriptomic and proteomic analysis of the effect of hydrogen peroxide on enterohemorrhagic Escherichia coli

本研究针对肠出血性大肠杆菌（EHEC）在氧化应激下毒力因子表达调控机制不清的问题，通过转录组学和蛋白质组学技术，系统分析了H2O2胁迫下EHEC O157:H7 EDL933菌株的全基因组响应。研究发现H2O2可激活SOS反应并显著调控Stx毒素基因表达，同时发现铁代谢、核糖体组装等关键通路的重编程现象。该研究为阐明EHEC致病机制提供了多组学证据，对开发新型抗感染策略具有重要意义。

　　

在食源性致病菌中，肠出血性大肠杆菌（EHEC）因其能引起出血性肠炎和溶血性尿毒综合征而备受关注。这种病原体的关键毒力因子——志贺毒素（Stx），其表达水平受到环境应激因素的精密调控。特别值得注意的是，当细菌遭遇氧化应激时，Stx毒素的产生会显著增强，这可能是感染过程中病情恶化的关键机制。然而，关于氧化应激如何全局性调控EHEC致病性的分子网络，至今仍存在大量未知。

为破解这一科学难题，挪威生命科学大学的研究团队在《Heliyon》上发表了创新性研究。他们采用多组学整合分析策略，深入探索了过氧化氢（H₂O₂）诱导的氧化应激对EHEC O157:H7标准菌株EDL933的全局影响。这项研究不仅揭示了氧化应激与细菌毒力之间的内在联系，更为控制EHEC感染提供了新的理论依据。

研究团队主要运用了转录组测序（RNA-Seq）和液相色谱-质谱联用（LC-MS/MS）技术。通过监测细菌生长曲线，他们在对数生长期添加3 mM H₂O₂，分别于处理后2小时（转录组）和3/12小时（蛋白质组）取样。转录组分析采用Illumina NovaSeq平台进行双端测序，使用DESeq2进行差异表达分析；蛋白质组则通过Orbitrap质谱仪检测，利用Proteome Discoverer软件进行标记自由定量。

全局变化

H₂O₂处理导致EDL933生长停滞5小时，菌落形成单位下降近1个对数级。转录组数据显示，在5370个注释基因中，2229个（41.5%）发生差异表达，其中1301个基因上调，928个下调。蛋白质组鉴定到1876个蛋白质，早期（3小时）响应较温和，而晚期（12小时）则出现184个显著差异蛋白。主成分分析显示处理组与对照组明显分离，但生物学重复间存在较大变异，反映了氧化应激反应的异质性。

氧化应激响应相关差异表达基因

研究人员鉴定出23个抗氧化损伤相关基因的显著变化。同源重组、DNA修复等相关基因强烈上调，而组氨酸、丙氨酸等氨基酸合成通路则被抑制。三羧酸循环（TCA）活性下降，磷酸戊糖途径被激活，这可能有利于还原型谷胱甘肽的生成。烷基过氧化氢还原酶基因ahpC和ahpF分别上调14.1倍和2.7倍，表明它们可能在H₂O₂解毒中发挥主要作用。

核糖体

暴露于H₂O₂后，核糖体基因和蛋白质表达显著增加，同时与休眠相关的Rmf和Hpf蛋白下调。这表明细菌通过增强蛋白质合成能力应对应激，而非进入真正的稳定期。

SOS响应

正如预期，H₂O₂处理激活了SOS反应。关键基因recA的mRNA水平上调13倍，其蛋白产物在3小时和12小时分别增加2.5倍和3.6倍。大多数差异表达基因参与DNA修复机制，但细胞分裂抑制蛋白SulA在3小时样本中含量降低50倍，这一现象与典型的SOS反应有所不同。

LEE致病岛及其他黏附相关基因的差异表达

引人注目的是，H₂O₂导致LEE致病岛的41个开放阅读框中35个基因下调2.1-114.2倍。在检测到的19个T3SS（III型分泌系统）蛋白中，8个在早期响应中下调。这种"去黏附"反应可能帮助细菌逃离高活性氧环境。然而在晚期（12小时），关键调控因子Ler和效应蛋白Tir、EspA等反而上调，表明时间动态在毒力调控中至关重要。

运动性

H₂O₂引起44个鞭毛和趋化相关基因上调，包括趋化受体基因aer（7.9倍）和tsr（12.7倍）。这种运动性增强可能帮助细菌逃离有害环境或定向移动到适宜生态位。CheZ与CheY的蛋白质比例变化表明，细菌可能从"翻滚"转向"直线游动"模式。

pO157致病性质粒

位于pO157质粒上的肠溶血素基因簇（ehxA、ehxB、ehxC、ehxD）上调5.1-6.9倍。相反，黏液酶基因stcE下调12.2倍，这可能减少中性粒细胞浸润。过氧化氢酶-过氧化物酶基因katP上调8.2倍，而抗限制蛋白基因（EDL933_p0075）更是惊人地上调76.9倍，可能保护细菌基因组免受降解。

噬菌体相关蛋白质和基因

研究检测到128个噬菌体来源的差异表达基因，其中39个来自Stx2噬菌体BP-933W，23个来自Stx1噬菌体CP-933V。stx2A和stx2B分别上调3.3倍和2.7倍，stx1A和stx1B上调约5倍。有趣的是，A、B亚基的表达比例不符合理论上的1：5 stoichiometry（化学计量关系）。噬菌体重组蛋白Bet和宿主核酸酶抑制蛋白GamW等也显著上调，可能增强噬菌体持久性。来自隐性原噬菌体CP-933C的DNA引物酶（EDL933_1781）在12小时样本中上调2061倍，是该研究中最显著的蛋白质变化。

铁获取

铁代谢相关基因是H₂O₂应答中最显著的上调群体。sufABCDSE操纵子（编码铁硫载体）上调111-500倍，肠菌素（enterobactin）生物合成和转运相关基因也显著激活。儿茶酚酸盐铁载体受体CirA上调125倍，它不仅参与铁摄取，还是Stx2a扩增微菌素的受体。然而，蛋白质水平的变化更为复杂，表明存在转录后调控机制。

翻译后修饰

研究人员观察到转录组和蛋白质组数据在功能层面上一致，但在单个分子水平上相关性较弱。这种差异可能源于采样时间点不同、蛋白质提取效率差异以及广泛的翻译后修饰（PTM）。检测到的大量PTM事件提示这是EHEC应激应答的重要调控层面。

本研究通过整合多组学方法，全面揭示了EHEC O157:H7应对H₂O₂诱导氧化应激的复杂调控网络。研究发现，氧化应激不仅激活了经典的抗氧化防御和DNA修复机制，还重编程了中心代谢途径，并动态调控了多种毒力因子。特别值得注意的是，铁获取系统的强烈激活、核糖体生物合成的增强以及噬菌体基因的差异表达，共同构成了EHEC适应氧化应激的多层次策略。

这些发现对理解EHEC在感染过程中的适应性进化具有深远意义。在宿主肠道内，上皮细胞和免疫细胞产生的活性氧是抗感染的第一道防线，而EHEC能通过精细调控基因表达网络，将这种攻击信号转化为增强毒力的契机。这种"危机变机遇"的机制可能部分解释了为何抗生素治疗有时会加剧EHEC感染——因为某些抗生素诱导的应激反应与氧化应激存在交叉对话。

该研究建立的全面数据集为后续功能研究提供了宝贵资源。特别是那些功能未知的差异表达基因（占15%），可能隐藏着EHEC致病性的新调控因子。未来研究可聚焦于关键节点蛋白的功能验证，以及不同应激信号交叉调控的机制探索，为开发针对EHEC应激应答通路的新型抗菌策略奠定基础。