通过合成生物学方法改造酵母以实现高效分离利奎里吉宁（isoliquiritigenin）的生产

《Science of Traditional Chinese Medicine》：Engineering yeast for high-efficiency isoliquiritigenin production via synthetic biology approaches

本研究通过整合优化酶基因、构建蛋白支架系统及调控代谢途径，成功将酿酒酵母中isoliquiritigenin的产量提升至70.6 mg/L，并显著降低副产物naringenin chalcone的比例至10.4%。该策略为微生物合成高价值5-脱氧黄酮提供了新范式。

　　### 随着现代生物技术的快速发展，利用微生物细胞工厂进行天然产物的异源合成已成为解决传统植物提取资源限制的有效手段。本文探讨了如何通过基因工程手段在酵母中实现一种重要天然产物——异甘草素（Isoliquiritigenin）的高效稳定生产。异甘草素是从传统中药甘草中提取的一种重要黄酮类化合物，因其在抗癌、抗炎、抗氧化、神经保护、抗病毒和降血糖等方面展现出广泛的应用潜力，因此其合成与生产具有重要的科学价值和实际意义。然而，目前异甘草素主要依赖于植物提取，这不仅受限于植物资源的可得性，还伴随着环境影响和成本问题。为了解决这些问题，研究者们尝试通过微生物细胞工厂进行异甘草素的合成，以实现可持续、可扩展的生产方式。

#### 异甘草素的生物合成路径

在植物中，异甘草素的合成通常始于苯丙烷途径。该途径中，L-苯丙氨酸通过苯丙氨酸氨裂解酶（PAL）、肉桂酸-4-羟化酶（C4H）和4-香豆酰辅酶A连接酶（4CL）转化为香豆酰辅酶A。随后，香豆酰辅酶A与三个乙酰辅酶A分子进行缩合反应，并在香豆素合酶（CHS）和香豆素还原酶（CHR）的催化下形成异甘草素（4,2′,4′-三羟基香豆素）。在这个过程中，CHS和CHR是两个关键酶，它们的催化效率直接影响异甘草素的产量。此外，异甘草素的合成过程中还可能产生一些副产物，如柚皮素香豆素（Naringenin chalcone），其比例对最终产物的纯度和经济性具有重要影响。

#### 酵母作为异源合成平台的优势

酵母作为一种高效的微生物细胞工厂，因其遗传操作的便利性、强大的代谢能力和广泛的工业应用背景，成为异源合成的首选宿主。在异甘草素的合成中，研究者通过整合优化的生物合成途径基因，构建了一种稳定的酵母底盘菌株，实现了异甘草素的高效生产。此外，通过引入非催化型香豆素异构酶（CHI）样蛋白和合成蛋白支架系统，增强了关键酶的代谢定向性，减少了副产物的生成。这一策略不仅提高了异甘草素的产量，还显著降低了柚皮素香豆素的比例，从而提升了整个合成过程的效率和产物的纯度。

#### 基因工程与代谢调控的结合

在构建酵母底盘菌株的过程中，研究者首先筛选并表征了与异甘草素合成相关的酶基因，如GuPAL1、GuC4H1、Gu4CL1、GuCHS1和GuCHR1。这些基因被整合到酵母的染色体中，形成了一种能够稳定表达这些酶的工程菌株。然而，仅仅依靠基因整合还不足以实现理想的产量，因此研究团队进一步优化了代谢网络，包括对前体物质和辅因子供应的调控。例如，通过敲除乙醇合成途径中的关键基因（如ARO10和PDC5），减少了L-苯丙氨酸的代谢分流，从而提高了其供应量。同时，通过过表达与NADPH生成相关的酶基因（如ZWF1、GND1、TKL1和TAL1），增强了NADPH的可用性，为CHR提供了更充足的辅因子支持，从而提高了其催化效率。

#### 代谢网络的优化策略

为了进一步提升异甘草素的产量，研究团队还对代谢网络进行了系统性优化。他们发现，单独调控某一路径（如乙酰辅酶A或苯丙氨酸合成途径）虽然能够提高某些代谢物的浓度，但往往导致代谢失衡，进而影响细胞生长和异甘草素的合成效率。因此，他们采用了双重调控策略，即同时优化乙酰辅酶A和苯丙氨酸合成途径，以确保两种前体物质的供应平衡。这一策略不仅缓解了代谢负担，还提高了细胞的适应能力，从而实现了更高的异甘草素产量。

此外，研究团队还探索了不同的代谢调控手段，如蛋白融合、人工蛋白支架系统以及天然代谢体（metabolon）的构建。这些方法旨在提高关键酶的催化效率，同时减少副产物的生成。其中，蛋白融合策略虽然能够增强酶的活性，但其在酵母中的应用仍存在一定的局限性，可能导致酶的构象改变，进而影响其催化效率。相比之下，人工蛋白支架系统虽然能够有效减少副产物的生成，但有时会抑制关键酶的活性。因此，研究团队最终选择了构建天然代谢体的方式，通过引入一种能够与CHS自然相互作用的CHI样蛋白GuCHI5，成功实现了异甘草素的高效合成。这种策略不仅提高了异甘草素的产量，还显著降低了柚皮素香豆素的比例，为异源合成提供了新的思路。

#### 碳源对异甘草素合成的影响

在实际生产过程中，碳源的选择对异甘草素的产量和细胞生长具有重要影响。研究团队通过调整培养基中的碳源类型和浓度，发现使用不同浓度的葡萄糖或蔗糖能够显著影响异甘草素的积累。例如，在使用4%葡萄糖作为碳源时，异甘草素的产量达到了70.6 mg/L，而使用2%蔗糖作为碳源时，异甘草素的产量也有所提高，但细胞生长并未显著变化。这一结果表明，碳源的释放速率和浓度在维持细胞生长和代谢平衡方面起着关键作用。此外，研究团队还发现，加入一定浓度的甘油能够提高细胞生物量，但对异甘草素的产量影响不大。因此，合理的碳源调控策略对于实现异甘草素的高效生产至关重要。

#### 未来研究方向与应用前景

尽管本研究在异甘草素的高效生产方面取得了显著进展，但仍有一些问题需要进一步探索。例如，如何进一步降低副产物的比例，如何提高异甘草素的产量，以及如何在大规模发酵条件下保持菌株的稳定性和适应性。此外，异甘草素作为5-脱氧黄酮类化合物的前体，其合成过程可能为其他结构复杂的5-脱氧黄酮类化合物的生产提供参考。因此，未来的研究可以围绕这些方向展开，以实现更高效的生物合成路径。

总之，本研究通过基因工程手段，成功构建了一种能够高效稳定生产异甘草素的酵母底盘菌株。通过优化生物合成途径、增强代谢定向性、调控前体和辅因子供应以及调整碳源，研究团队不仅提高了异甘草素的产量，还显著降低了副产物的比例。这些成果为异甘草素及其他高价值天然产物的微生物合成提供了重要的参考，也为未来生物制造技术的发展奠定了基础。