牛传染性鼻气管炎病毒诱导线粒体损伤中环状RNA的鉴定与功能研究

《BMC Genomics》：Identification and functional analysis of circular RNAs during mitochondrial damage induced by infectious bovine rhinotracheitis virus infection in Madin–Darby bovine kidney cells

本研究针对IBRV感染诱导MDBK细胞线粒体损伤的机制不明问题，通过高通量测序技术筛选出144个差异表达circRNA，构建ceRNA调控网络并验证circ_002584/circ_004326对线粒体功能的调控作用。结果表明circRNA通过源基因、miRNA海绵和RBP相互作用参与病毒性线粒体损伤调控，为IBR诊断标志物和治疗靶点开发提供理论依据。

　　

在畜牧业领域，牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)如同潜伏的"破坏者"，不仅引发呼吸道疾病、生殖障碍等临床症状，更能在感染后终身潜伏于三叉神经节，给全球养牛业造成重大经济损失。然而，与病毒持久战的过程中，科学家们发现IBRV感染会导致宿主细胞线粒体——这个细胞的"能量工厂"出现功能紊乱，但具体分子机制始终笼罩在迷雾中。

近年来，环状RNA(circRNA)作为非编码RNA家族的新星，因其闭合环状结构带来的稳定性优势，在调控线粒体功能方面展现出巨大潜力。已有研究表明，在冠状病毒感染等病理过程中，circRNA能通过ceRNA机制或与RNA结合蛋白(RBP)相互作用影响线粒体通透性转换孔(mPTP)开放和活性氧(ROS)积累。那么，在IBRV与宿主细胞的博弈中，circRNA是否也会扮演重要角色？这个问题激发了新疆农业大学马雪莲教授团队的研究兴趣。

为揭开这一谜题，研究团队在《BMC Genomics》发表了题为"Identification and functional analysis of circular RNAs during mitochondrial damage induced by infectious bovine rhinotracheitis virus infection in Madin-Darby bovine kidney cells"的研究论文。他们通过多组学整合分析并结合功能验证，首次系统揭示了circRNA在IBRV诱导线粒体损伤中的调控网络。

关键技术方法包括：采用透射电镜(TEM)观察线粒体超微结构，激光共聚焦显微镜和流式细胞术检测ROS水平与线粒体膜电位(MMP)变化；对IBRV感染的MDBK细胞进行circRNA、mRNA和miRNA高通量测序；通过生物信息学构建ceRNA调控网络和circRNA-RBP互作网络；使用RNase R酶切实验验证circRNA稳定性，荧光原位杂交(FISH)确定亚细胞定位；利用siRNA干扰技术进行功能验证。

IBRV感染诱导MDBK细胞线粒体损伤

通过PCR验证病毒复制能力后，电镜观察发现感染组线粒体出现肿胀变形和嵴断裂现象。功能检测显示IBRV感染使ROS积累显著增加（p<0.05），同时引起MMP去极化（p<0.05），证实病毒确实诱导线粒体结构和功能损伤。

高通量测序数据概览

测序共识别4,367个circRNA，其中外显子来源circRNA占比最高(64.52%)，长度集中在200-800nt。同时获得21,730个mRNA和2,022个miRNA，为后续分析奠定数据基础。

差异表达分子筛选

发现144个差异表达circRNA(83个上调/61个下调)，725个差异mRNA(528个上调/197个下调)和160个差异miRNA(93个上调/67个下调)。热图显示感染组与对照组表达谱存在显著差异。

circRNA源基因功能富集

137个circRNA源基因中，11个定位于线粒体，KEGG分析显示这些基因显著富集于mTOR、甲状腺激素和Hippo等线粒体相关信号通路。

miRNA靶基因调控网络

5,256个候选靶基因中，471个与线粒体相关，主要涉及细胞衰老、线粒体自噬等通路。通过circRNA-miRNA-mRNA网络预测发现2,563对circRNA-miRNA调控关系和2,178对miRNA-线粒体相关mRNA关系。

ceRNA调控网络构建

网络可视化显示106个circRNA通过吸附56个miRNA调控389个线粒体相关mRNA，形成复杂调控网络。红色节点代表上调分子，绿色代表下调分子。

circRNA-RBP互作分析

预测发现141个circRNA可与961个RBP结合，其中107个RBP定位于线粒体。这些RBP主要参与核质运输、RNA降解等通路，构建的互作网络揭示circRNA可能通过结合RBP影响线粒体功能。

关键circRNA验证

选择circ_002584和circ_004326进行验证，RNase R实验证实其环状结构稳定性。FISH定位显示二者主要分布于细胞质，感染后表达显著上调（p<0.05）。

功能验证实验

siRNA干扰实验表明，敲低circ_002584可显著降低ROS积累和MMP去极化（p<0.05），而敲低circ_004326则产生相反效果（p<0.01），证实二者分别具有促进和抑制线粒体损伤的功能。

研究结论与意义

本研究首次揭示IBRV感染通过改变circRNA表达谱诱导线粒体损伤的分子机制。circ_002584和circ_004326被证实分别作为正负调控因子通过ceRNA机制影响线粒体功能。这些发现不仅为理解病毒致病机制提供新视角，更为开发基于circRNA的IBR诊断标志物和治疗靶点奠定理论基础。尽管研究存在体外模型的局限性，但为后续探索circRNA编码潜能及其在动物体内的调控功能指明了方向。