高原植物山莨菪HSF基因家族进化与功能解析揭示其耐热适应性分子机制

《BMC Plant Biology》：Evolutionary and functional insights into HSF gene family underpin thermal adaptation in the plateau plant Anisodus tanguticus

本研究针对高原药用植物山莨菪(Anisodus tanguticus)面临的气候变暖威胁，通过全基因组进化分析和功能解析，系统鉴定了20个HSF转录因子家族成员。研究发现AntHSF基因通过串联复制和片段复制事件形成谱系特异性分化，其表达动态与抗氧化酶活性变化显著相关，其中AntHSF7和AntHSF9可能参与高原特异性适应。该研究为解析山莨菪热适应机制提供了新见解，对保护这一气候脆弱型药用物种具有重要指导意义。

　　

随着工业化进程加速，温室气体排放导致全球气温急剧上升，严重威胁着药用植物生态系统的可持续性。过去一个世纪，大气CO₂浓度激增近50%，全球平均气温较工业化前上升1.1℃，预计到2100年高温室气体排放情景下将再升高2.5-4.5℃。这些气候变化表现为温度升高、降水模式异常和极端天气事件加剧，共同导致生态位不稳定。对于药用植物，特别是高海拔地区特有的物种而言，这些变化引发分布区收缩、种群破碎化和灭绝风险升高。

高原生态系统如青藏高原，作为山莨菪(Anisodus tanguticus)的栖息地，受到的影响尤为严重。这些地区的特有物种在千百年稳定的寒冷条件下进化，使其对微小的温度升高都极为敏感。例如，高寒地区温度升高2℃可使物候期提前3-4周，导致植物-传粉者相互作用失调，降低繁殖成功率。与此同时，过度采挖、放牧和土地利用变化等人为压力加剧了这些脆弱性，将山莨菪等物种推向生态临界点。

山莨菪作为青藏高原特有的多年生草本药用植物，其生态脆弱性与药用价值高度重合。该物种合成的莨菪烷类生物碱（如东莨菪碱和阿托品）是治疗神经系统疾病、晕动症和帕金森病的重要药物原料。全球对这些化合物的年需求量超过500吨，驱动着数百万美元的制药产业。然而，山莨菪在其原生分布区（海拔2800-4200米的西藏、青海和四川）正逐渐消失，自20世纪80年代以来种群密度骤降70%。更严峻的是，气候模型预测到2100年青藏高原温度将上升3-5℃，这将使本已处于温度耐受极限的物种面临更严重的热胁迫威胁。

在植物应对热胁迫的分子机制中，热休克转录因子(HSF)作为主调控因子，通过激活分子伴侣(HSP)来减轻蛋白质变性并维持细胞稳态。HSF介导的胁迫响应通过级联反应进行：通过组氨酸激酶等膜传感器感知温度波动后，HSF发生磷酸化依赖性激活，形成三聚体并核转位。这些激活的复合物与HSP基因启动子中的热休克元件(HSE)结合，触发HSP70和HSP90等伴侣蛋白的合成，从而在胁迫下保持蛋白质稳态。

尽管HSF家族在植物中的进化多样化反映了其适应重要性，但栖息在热波动环境中的极端植物（如高山植物）的研究仍然不足，这留下了理解HSF进化如何支撑生态适应性的关键空白。

为解决这一知识空白，研究人员对山莨菪HSF基因家族进行了全基因组进化与功能解析。研究采用基因组学、转录组学和分子生物学相结合的方法，通过HMMER3和HSF型DBD模型(PF00447)从山莨菪全基因组数据中筛选候选基因，利用CD-Search和SMART工具验证DBD结构域完整性。通过最大似然法构建系统发育树，使用MEME进行保守基序分析，利用PlantCARE数据库预测启动子顺式作用元件。通过RNA-seq和qRT-PCR分析基因表达谱，采用农杆菌介导的烟草瞬时转化进行亚细胞定位实验。样本来自成都第一制药有限公司提供的野生种子，在控制光照、温度和湿度条件下进行35℃热胁迫处理，在不同时间点采集样品进行酶活性测定和基因表达分析。

热胁迫影响山莨菪氧化酶活性

35℃连续高温处理三天后，观察到植株叶片出现萎蔫现象。对抗氧化酶活性的测定显示，地上部和地下部在不同处理时间点呈现动态变化模式。过氧化氢(H₂O₂)含量在12小时和24小时热胁迫后持续增加，表明氧化胁迫加剧。超氧化物歧化酶(SOD)活性先升高后降低，说明抗氧化防御机制先激活后可能失效。过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)活性呈现波动变化，而丙二醛(MDA)含量逐步下降，表明膜脂过氧化减轻，可能由于抗氧化酶增强和适应性脂质代谢稳定了膜完整性。

转录组学分析揭示HSF在热胁迫中的关键作用

转录组分析发现，热处理4小时后有39025个基因表达，6小时后仅有24139个基因检测到转录活性。4小时处理时161个差异表达基因(DEG)上调，65个下调；6小时时108个上调，41个下调。GO功能注释显示DEGs显著富集在过氧化氢响应、热响应、活性氧(ROS)响应、生长正调控、未折叠蛋白结合和热休克蛋白结合等通路。KEGG富集分析表明DEGs主要富集在内质网蛋白质加工、内吞作用和氧化磷酸化等通路。进一步分析发现HSF和HSP基因表达变化显著，提示它们在热胁迫响应中起关键调控作用。

山莨菪HSF基因的全基因组鉴定

通过HMMER3和BLASTP搜索，结合DBD保守性验证，共鉴定出20个非冗余AntHSF基因(AntHSF1-20)。这些蛋白长度从122到501个氨基酸不等，分子量14.09-55.87kDa，等电点(pI)范围4.75-9.25，平均GRAVY值为-0.7012，表明为亲水性蛋白。亚细胞定位预测显示大多数蛋白在细胞核和细胞质中表达。

AntHSFs的多序列比对和系统发育分类

最大似然法系统发育树将AntHSFs分为三大类：HSFA、HSFB和HSFC。HSFA类包含13个成员，分为A1-A8亚组；HSFB类有6个成员，分为B1-B4亚组；HSFC类仅有1个成员。这种分类验证了蛋白质结构的多样性，表明不同亚家族成员可能具有不同的调控功能。

AntHSFs基因结构分析

基因结构分析显示同一组内HSF基因通常具有相似的内含子数量。保守基序分析鉴定出10个不同的基序，同一亚组的AntHSFs显示高度一致的保守基序。启动子分析发现38个顺式作用元件，分为非生物和生物胁迫、植物激素响应以及植物生长发育等类别。几乎所有AntHSF基因启动子区都含有大量光响应元件，表明与环境因子响应存在协同协调。

AntHSF基因的染色体定位和共线性分析

染色体定位图显示AntHSF基因在14条染色体上分布不均匀且相对分散。同一亚家族的基因在同一或相邻染色体上位置相近。共线性分析显示AntHSF基因家族与双子叶植物HSF基因具有较强的同线性关系，其中亚麻芥(Camelina sativa)同线性程度最高，其次是拟南芥(Arabidopsis thaliana)和番茄(Solanum lycopersicum)。Ka/Ks比值分析表明HSF基因家族在进化过程中可能经历了强烈的纯化选择。

山莨菪HSF基因家族成员表达差异

基于RNA-seq数据的表达谱分析显示，部分基因如AntHSF3、AntHSF12和AntHSF18可能在热胁迫1-3小时内快速上调，表明它们参与即时胁迫信号传导。其他基因如AntHSF7和AntHSF20表现出延迟激活，在6小时后达到峰值，提示参与长期胁迫适应或恢复过程。qRT-PCR验证发现7个HSF基因在不同组织中呈现不同的响应模式，表明它们在高温胁迫调控中可能发挥动态作用。

AntHSF6、AntHSF7和AntHSF9的亚细胞定位

亚细胞定位实验显示，AntHSF6的RFP融合蛋白主要定位于细胞核，少量分布于质膜；AntHSF7蛋白主要位于内质网，提示参与氧化胁迫相关的生物过程；AntHSF9蛋白主要分布在细胞核，表明可能参与核内基因表达调控。

研究结论与意义

本研究通过整合生理学、转录组学和进化分析，揭示了山莨菪多层次的热适应机制。该物种采用分层氧化胁迫管理系统，通过瞬时的SOD活性激增和随后的CAT、POD活性协调，实现战略性ROS中和。转录重编程显示山莨菪对热响应的进化优化，68.3%的DEG在4小时内立即响应，反映了对高原环境极端昼夜温度波动的适应。

20个AntHSF基因的鉴定揭示了HSF调控网络的核心作用。启动子分析发现胁迫响应顺式元件的异常密度（平均12.3个元件/基因），超出热响应元件范围，包括ABA响应元件(ABRE)和干旱诱导序列，表明山莨菪采用组合胁迫信号策略。85%的AntHSF启动子中光响应元件的共存暗示热耐受的光周期调控，这是高UV环境的关键适应。

功能特异性分析表明，AntHSF7具有启动子中富集的光响应顺式元件和内质网定位的双重调控特征，可能是环境感知和细胞器特异性胁迫管理的独特适应机制。AntHSF6与AntHSF7的系统发育聚类提示基因复制后的分化进化，可能由亚功能化或新功能化驱动。AntHSF9的核定位和持续上调定位其为转录协调器，其在"氧化酶活性"通路中的富集表明在ROS信号和蛋白质稳态中的双重作用。

与其它被子植物相比，AntHSF家族的紧凑规模（20个基因）反映了进化历史和环境压力。共线性分析显示与双子叶植物HSF有68%的同线性，与单子叶植物仅22%，符合分子测年显示的山莨菪在单子叶-双子叶植物分化后分歧的位置。

阶段特异性适应策略对保护具有关键意义。幼苗在早期抑制阶段（0-12小时）的脆弱性与西藏夏季午后峰值UV-B辐射同时发生，产生协同胁迫。成熟植物的延迟响应范式暗示固有韧性，但在长期热浪期间存在代谢失衡风险。AntHSF16介导的生长调控与胁迫响应之间的权衡，突出了平衡生产力和胁迫耐受性的普遍挑战。

该研究为理解高原植物热适应机制提供了新视角，为山莨菪这一气候脆弱型药用物种的保护和品种改良提供了候选耐热基因和遗传路线图。未来研究应优先进行CRISPR-Cas9验证、表观遗传调控和生态基因组学分析，将这些发现转化为可持续的保护实践，确保这一生态和药学宝藏在变暖世界中的持续存在。