树突状细胞DNMT1表观遗传重编程通过IL-12b/TIM4轴调控过敏性气道炎症中Th2偏移的新机制

《Cell Communication and Signaling》：Epigenetic reprogramming of dendritic cells by DNMT1 inhibition attenuates Th2 skewing in allergic airway inflammation

本研究针对过敏性哮喘中树突状细胞(DC)介导Th2极化的表观遗传机制不清问题，开展DNMT1抑制对DC表观遗传重编程的主题研究。发现DNMT1通过甲基化沉默IL-12b和稳定TIM4的双重机制驱动Th2偏移，DNMT1抑制剂5-azadC可逆转这一过程。该研究为哮喘的Th1/Th2免疫失衡提供了新的治疗靶点。

　　

当过敏原侵入呼吸道时，我们的免疫系统如何做出反应？为什么有些人会发展为过敏性哮喘，而有些人却不会？这背后隐藏着复杂的免疫调控机制。过敏性哮喘作为一种慢性气道炎症性疾病，其特征是辅助性T细胞2（Th2）免疫应答异常，导致气道高反应性和炎症细胞浸润。在免疫系统中，树突状细胞（DC）作为关键的抗原呈递细胞，在调控Th1/Th2平衡中扮演着核心角色。然而，关于表观遗传调控特别是DNA甲基化如何影响DC功能并导致Th2偏斜的机制仍不清楚。

近年来，表观遗传学研究揭示了DNA甲基转移酶（DNMT）在免疫调控中的重要作用。DNA甲基化是通过在基因启动子区域的CpG岛添加甲基基团来沉默基因表达的表观遗传修饰方式。DNMT1作为主要的DNA甲基转移酶，在癌症和自身免疫疾病中已被广泛研究，但其在DC介导的过敏性炎症中的具体功能尚不明确。特别值得注意的是，白细胞介素12b（IL-12b）作为一种重要的Th1极化细胞因子，在哮喘患者中表达常常受到抑制，但其下调的表观遗传机制尚未阐明。同时，T细胞免疫球蛋白域分子4（TIM4）作为DC上的磷脂酰丝氨酸受体，能够增强Th2细胞的活化。在过敏性炎症中，TIM4表达上调，但其是否受到表观遗传调控以及与IL-12b之间的相互作用关系仍未知。

在这项发表于《Cell Communication and Signaling》的研究中，薛金梅等人深入探讨了DNMT1在DC中介导Th2极化的分子机制。研究人员提出假设：DC中的DNMT1通过双重机制维持Th2极化——一方面通过甲基化依赖性方式沉默Il12b基因，削弱Th1应答；另一方面通过稳定TIM4表达，而TIM4的稳定性受到IL-12b介导的泛素化调控。

为了验证这一假设，研究团队结合了屋尘螨（HDM）诱导的小鼠哮喘模型、DC特异性Dnmt1基因敲除（Dnmt1^fl/fl Itgax-Cre）、药物性DNMT1抑制（5-氮杂-2'-脱氧胞苷，5-azadC）以及多种分子生物学技术，包括染色质免疫沉淀（ChIP）、实时荧光定量PCR（RT-qPCR）和泛素化分析，系统性地解析了DC中IL-12b和TIM4的甲基化依赖性调控机制。

主要实验技术包括：使用屋尘螨提取物（DME）诱导的小鼠过敏性哮喘模型、骨髓来源树突状细胞（BMDC）的分离和培养、酶联免疫吸附试验（ELISA）检测细胞因子、甲基化特异性定量PCR（MS-qPCR）分析Il12b启动子甲基化状态、流式细胞术进行免疫细胞分型和细胞内细胞因子染色、染色质免疫沉淀（ChIP）分析转录因子和组蛋白修饰结合、泛素化实验检测TIM4降解机制，以及DC与CD4⁺ T细胞共培养实验评估Th2极化能力。

抑制全局甲基化下调气道Th2反应

研究团队成功建立了屋尘螨诱导的小鼠过敏性气道炎症模型。与对照组相比，致敏小鼠表现出明显的过敏性哮喘临床症状，气道高反应性增强，支气管肺泡灌洗液（BALF）中炎症细胞总数和Th2细胞因子（IL-4、IL-5、IL-13）水平显著升高，而Th1细胞因子（IFN-γ和TNF-α）水平降低。使用DNMT抑制剂5-azadC处理后，过敏症状评分、气道阻力和Th2细胞因子水平均显著降低，表明DNA甲基化在Th2极化中起关键作用。

抑制树突状细胞中甲基转移酶DNMT1可抑制气道过敏性炎症

通过DC特异性Dnmt1基因敲除（KO）小鼠模型，研究人员发现，与对照（cKO）小鼠相比，Dnmt1缺失显著减轻了DME诱导的气道炎症，表现为支气管周围炎症细胞浸润减少，BALF中嗜酸性粒细胞计数、嗜酸性粒细胞过氧化物酶（EPX）、肥大细胞蛋白酶-1（Mcpt1）和Th2细胞因子水平均显著下降。组织学分析进一步证实KO小鼠肺部炎症和黏液产生减少。这些结果表明，遗传和药物抑制DC中的DNMT1均可减轻过敏性炎症，突出了DC特异性甲基化作为治疗靶点的潜力。

DNA甲基化抑制逆转致敏诱导的树突状细胞中IL-12b产生的抑制

从过敏性哮喘（AA）小鼠肺部分离的单个核细胞中，IL-12b⁺ DC的比例显著降低，而IL-12a⁺ DC比例无变化。5-azadC处理可恢复AA小鼠中IL-12b⁺ DC的频率至正常水平。纯化的DC中，AA小鼠来源的DC显示IL-12b mRNA表达降低74%，经5-azadC处理后恢复正常。这些结果表明，致敏通过甲基化机制特异性抑制DC中IL-12b的表达，而DNMT1抑制可逆转这一效应。

DNA甲基化抑制恢复致敏诱导的树突状细胞Il12b启动子表观遗传失调

AA小鼠来源的DC中，转录因子PU.1与Il12b启动子的结合减少，而c-Rel结合无变化。5-azadC处理可恢复PU.1的结合。Il12b启动子区域显示DNA甲基化水平增加1.8倍，组蛋白修饰H3K4me3富集增加4.7倍。5-azadC处理使启动子甲基化降低57%，H3K4me3富集降低84%，并恢复RNA聚合酶II（Pol II）结合，使Il12b mRNA和蛋白表达恢复正常。这些结果表明，5-azadC可正常化Il12b启动子的甲基化和组蛋白修饰，挽救PU.1结合和转录活性。

致敏诱导的树突状细胞TIM4上调和IL-12b抑制驱动Th2极化

AA小鼠气道DC中TIM4 mRNA和蛋白表达上调。DME刺激的BMDC显示TIM4表达呈剂量依赖性上调，而IL-12b表达受抑制。脂多糖（LPS）共处理可减弱DME诱导的TIM4上调并恢复IL-12b表达。Il12b^-/- BMDC即使经DME和LPS处理，仍保留诱导Th2极化的能力（IL-4增加7.3倍）。这些发现表明，DME诱导的DC中TIM4上调和IL-12b抑制共同驱动Th2极化，而TLR4激活可对抗这一效应。

DNA甲基化抑制通过IL-12b介导的泛素化和DNMT1-TIM4轴减弱致敏气道树突状细胞中TIM4的产生

AA DC中DNMT1在Il12b启动子的占据增加7.3倍，且与TIM4表达水平正相关。DME刺激的BMDC中DNMT1结合增加10.9倍，TIM4表达上调4.9倍，而5-azadC处理可抑制TIM4上调。IL-12b通过Trim28介导的K48连接泛素化促进TIM4降解，蛋白酶体抑制剂MG132可阻断此过程。Timd4敲低破坏了DNMT1在Il12b启动子的招募，而LPS处理可恢复PU.1-STAT6转录复合物形成。这些结果揭示了一个反馈回路：TIM4维持DNMT1驱动的Il12b高甲基化，而IL-12b通过泛素化 destabilizes TIM4，减轻Th2极化。

本研究系统阐明了DC中DNMT1通过表观遗传和翻译后机制调控Th2极化的新通路。DNMT1介导的Il12b启动子高甲基化导致IL-12b表达沉默，同时TIM4表达上调，二者共同促进Th2偏斜。重要的是，研究发现IL-12b可通过促进TIM4的泛素化降解而负反馈调节TIM4表达，形成自我限制回路。DNMT1抑制剂5-azadC可破坏这一回路，恢复免疫平衡。

这一发现不仅深化了对过敏性哮喘发病机制的理解，也为治疗干预提供了新靶点。靶向DNMT1和TIM4可能成为恢复哮喘患者Th1/Th2平衡的新策略，特别是对于对皮质类固醇或生物制剂耐药的Th2高内型患者。此外，研究揭示了DNA甲基化与组蛋白修饰在调控免疫基因表达中的复杂相互作用，即使存在激活性的组蛋白标记（H3K4me3），DNA甲基化仍可主导基因沉默，这一现象在过敏炎症中此前未被充分认识。

研究的局限性包括5-azadC作为广谱DNMT抑制剂可能靶向多种细胞类型，以及需要进一步在人类DC和临床队列中验证这些发现。未来研究应探索DNMT1与其他表观遗传调控因子（如TET酶）在DC中的相互作用，以及IL-12b在非DC细胞类型中的作用。

总之，这项研究揭示了DC中DNMT1-IL-12b-TIM4轴在过敏性哮喘Th2极化中的核心作用，为开发表观遗传疗法补充现有哮喘治疗策略提供了理论依据，强调了针对特定表观遗传靶点重新编程免疫细胞功能的治疗潜力。