通过反向PCR和纳米孔测序技术快速检测活体转基因蝴蝶兰（Phalaenopsis）中的转基因插入模式，并在Illumina和PacBio测序平台上进行了验证

《Plant Biotechnology Reports》：Rapid detection of transgene insertion patterns in living modified Phalaenopsis via inverse PCR and nanopore sequencing validated against Illumina and PacBio sequencing platforms

快速检测转基因及其功能对LMOs分子鉴定至关重要。本研究开发iPCR-Nanopore分层检测流程，结合Illumina高精度测序和PacBio长读长结构解析，成功定位Phalaenopsis事件311 NR的T-DNA插入位点，建立靶向检测与完整结构解析的协同机制。

　　

摘要

快速检测插入的转基因及其基因组功能对于活体改性生物（LMOs）的分子特征分析至关重要。Phalaenopsis事件311 NR携带一个T-DNA盒，其中包含CaMV 35S启动子、TMV Omega、hygromycin磷酸转移酶、Commelina communis F3′5′H基因以及CaMV终止子，这些成分共同导致了花朵呈现蓝紫色，这与花青素生物合成的改变相符。通用PCR筛查证实了CaMV 35S启动子（142 bp）和nos终止子（194 bp）片段的存在。为了提高检测特异性，分别设计了针对CaMV 35S启动子和nos终止子的四对引物，并在Gateway入门载体上进行了验证，确定60°C为最佳退火温度。将这些引物应用于基因组DNA后，获得了约3 kb和1 kb的接合位点信息扩增子。跨平台的比较测序显示了各自的互补优势：Illumina提供了高准确性和高覆盖率，适用于检测保守元件；而PacBio则能够实现插入位点的结构解析。纳米孔测序结合反向PCR富集技术，有效浓缩了含有接合位点的分子，有助于恢复跨越插入片段及其两侧基因组区域的转基因元件。不同平台得到的contigs均保持了调控元件和标记元件的保守顺序，从而支持了结构信息的准确解读。这些结果表明，iPCR-Nanopore技术是一种成本效益高且适用于现场操作的快速检测和接合位点定位方法；而Illumina和PacBio在完成基因位点重建方面仍然不可或缺。这三个平台共同构建了一个分层的工作流程：首先进行靶向检测，随后进行全面的结构解析，从而推动了观赏植物中LMOs的分子监测。