LncRNA ENST00000532153.1通过抑制PARP1介导的ATF3 PARylation减轻糖尿病肾病足细胞损伤

《Cellular and Molecular Life Sciences》：LncRNA ENST00000532153.1 alleviates podocyte injury by inhibiting PARP1-mediated PARylation of ATF3 in diabetic kidney disease

本研究针对糖尿病肾病(DKD)中足细胞损伤的关键问题，聚焦长链非编码RNA ENST00000532153.1(lncRNA 153)的功能机制。研究人员通过RNA测序发现lncRNA 153在DKD患者中表达下调，进一步实验证实其过表达可减轻高葡萄糖(HG)诱导的足细胞损伤。机制研究表明lncRNA 153与PARP1蛋白结合，抑制其与转录因子ATF3的相互作用，进而降低ATF3的转录活性，最终通过抑制内质网应激和细胞凋亡缓解足细胞损伤。该研究为DKD治疗提供了新的潜在靶点。

　　

糖尿病肾病(DKD)作为糖尿病最常见的微血管并发症，已成为导致慢性肾脏病(CKD)的主要因素。目前肾活检仍是DKD诊断的金标准，但迫切需要无创诊断方法。更严峻的是，有效阻止DKD进展的药物十分有限。足细胞是肾小球滤过屏障的重要组成部分，其损伤和丢失是DKD等慢性肾脏疾病的关键指标。因此，探索DKD中新的差异表达基因和蛋白质，深入研究足细胞损伤机制，可能为DKD的诊断和治疗开辟新途径。

近年来研究发现，长链非编码RNA(lncRNA)在人体组织中广泛存在，参与细胞增殖、内质网应激、自噬和凋亡等多种生物学过程。为识别DKD中差异表达的lncRNA，研究人员对DKD患者肾组织样本进行RNA测序(RNA-seq)，发现lncRNA ENST00000532153.1(lncRNA 153)在DKD组中表达下调，但其在DKD进展过程中足细胞损伤中的作用尚不清楚。

同时，多聚ADP核糖聚合酶(PARP)家族作为NAD⁺依赖性酶类，在DNA损伤感知和细胞信号传导中发挥重要作用。既往研究表明PARP抑制可减轻糖尿病中的蛋白尿和全身氧化应激，还能通过减少炎症、氧化应激和肾纤维化改善糖尿病肾病。然而，PARP家族成员在糖尿病肾病中的具体作用仍不明确。值得注意的是，lncRNA本身不具有固有生物学功能，通常通过与microRNA、mRNA、DNA或蛋白质相互作用发挥功能。

本研究发表在《Cellular and Molecular Life Sciences》杂志，研究人员通过RNA-pulldown和质谱分析发现PARP1与lncRNA 153存在相互作用，且这种相互作用不涉及其他PARP家族成员。PARP1作为一种核蛋白，可催化多种底物蛋白的多聚ADP核糖基化(PARylation)，在细胞损伤时被激活以修复受损DNA。然而，PARP1的过度激活可能导致细胞死亡和凋亡。PARP-1的激活对糖尿病并发症的发展至关重要，包括心肌病、血管病变、神经病变和视网膜病变。但PARP1与DKD足细胞损伤之间的潜在联系尚未被研究。

另一方面，内质网(ER)中未折叠或错误折叠蛋白的积累会引发内质网应激，激活未折叠蛋白反应(UPR)。如果UPR的适应性反应不足以缓解内质网应激，最终可能导致细胞凋亡。基于RNA-pulldown和KEGG分析，研究人员推测lncRNA153和PARP1在DKD的内质网应激和凋亡中发挥重要作用。

本研究主要运用了以下关键技术方法：通过RNA测序筛选差异表达lncRNA；利用RNA-pulldown结合质谱技术鉴定RNA结合蛋白；采用免疫共沉淀(Co-IP)和邻近连接 assay(PLA)验证蛋白相互作用；通过染色质免疫沉淀(ChIP)和双荧光素酶报告基因 assay分析转录因子活性；建立足细胞特异性PARP1敲除小鼠模型进行功能验证；使用透射电镜观察足细胞超微结构变化。研究样本包括来自山东第一医科大学附属省立医院的肾活检组织和人血清样本，以及STZ诱导的DKD小鼠模型和db/db小鼠。

LncRNA 153在人类DKD中表达下调

RNA-seq分析显示，DKD患者肾组织中lncRNA 153表达显著下调。验证实验证实，与正常葡萄糖(NG)条件相比，高葡萄糖(HG)刺激可降低lncRNA 153表达。组织学分析发现DKD患者肾组织出现肾小球节段性硬化、系膜基质增生、GBM增厚和纤维化等病理改变。透射电镜显示DKD组GBM显著增厚，足突融合。RNA荧光原位杂交(FISH)染色显示，lncRNA 153与足细胞标志蛋白podocin共定位，且在足细胞损伤时表达降低。重要的是，肾小球中lncRNA 153水平与估算肾小球滤过率(eGFR)呈正相关，与尿白蛋白/肌酐比值(ACR)呈负相关。

临床样本分析进一步显示，DKD患者血清中lncRNA 153水平降低，且大量蛋白尿组表达低于微量蛋白尿组。相关性分析表明，血清lncRNA 153水平与eGFR正相关，与血肌酐(SCr)、ACR和胱抑素C(Cys C)水平负相关。

过表达LncRNA 153减轻高葡萄糖诱导的足细胞损伤

为探究lncRNA 153在DKD中的作用，研究人员构建了lncRNA 153小干扰RNA(siRNA)和过表达质粒。实验发现，与NG组相比，HG组ZO-1表达降低，Desmin表达升高，细胞骨架排列紊乱。而过表达lncRNA 153可逆转这些变化，减轻足细胞损伤。相反，敲低lncRNA 153可诱导足细胞损伤。

LncRNA 153与足细胞中PARP1相互作用

为阐明lncRNA 153的功能机制，研究人员利用生物素标记的lncRNA 153进行RNA pull-down和质谱分析，筛选结合蛋白。通过与catRAPID数据库预测的结合蛋白进行重叠分析，发现9个lncRNA 153的潜在伙伴，包括PARP1。Western blot证实PARP1特异性地存在于lncRNA 153 pull-down复合物中。RNA免疫沉淀(RIP)实验进一步验证了PARP1与lncRNA 153的相互作用，且HG处理降低了它们的结合亲和力。免疫荧光显示HG降低了lncRNA 153和PARP1在足细胞中的共表达。

有趣的是，过表达lncRNA 153可降低HG引起的PARP1蛋白表达增加，但不影响其mRNA表达。相反，敲低lncRNA 153可促进PARP1蛋白水平表达。使用蛋白质合成抑制剂CHX的实验表明，lncRNA 153调控PARP1蛋白合成。

PARP1影响内质网应激并参与HG诱导的足细胞损伤和凋亡

RNA pull-down后的KEGG分析表明，lncRNA153富集的蛋白主要参与内质网中的蛋白质加工，且PARP1与凋亡密切相关。研究人员发现，过表达lncRNA 153可通过IRE1/XBP1s/CHOP通路抑制HG诱导的内质网应激。敲低PARP1可改善HG引起的ZO-1表达降低和Desmin表达升高，部分逆转内质网应激相关蛋白(IRE1、XBP1s、GRP78和CHOP)的表达变化，并减少足细胞凋亡。使用PARP1抑制剂PJ34也可缓解HG诱导的内质网应激、凋亡和足细胞损伤。相反，过表达PARP1可增强足细胞的内质网应激、凋亡和损伤。

PARP1参与体内内质网应激、凋亡和足细胞损伤

研究人员发现DKD患者肾组织中PARP1表达显著上调，且肾小球PARP1水平与足细胞丢失(WT-1染色)负相关，与ACR正相关。在STZ诱导的DKD小鼠和db/db小鼠中，PARP1表达随时间推移增加，且与肾小球病变和足细胞损伤加重正相关。

为阐明足细胞PARP1在DKD中的功能，研究人员通过尾静脉注射AAV9-nphs1-shPARP1构建足细胞特异性PARP1敲低小鼠，并用STZ诱导DKD模型。结果显示，与WT组相比，STZ组ACR水平和肾重/体重比显著增加，而PARP1敲低后这些指标降低。PAS和免疫组化染色显示，STZ诱导小鼠糖原积累显著增加，WT-1阳性细胞减少，这些变化在PARP1敲低后明显缓解。透射电镜显示PARP1敲低减轻了STZ引起的足突融合和GBM增厚。Western blot和real-time PCR显示，PARP1敲低小鼠肾皮质中IRE1、XBP1s、GRP78、CHOP、BAX和Desmin水平显著降低，而BCL2和ZO-1表达增加。腹腔注射PJ34也得到类似结果。

PARP1介导的ATF3 PARylation调控基因表达

为识别lncRNA 153和PARP1的潜在靶点，研究人员进行RNA-seq，发现99个差异表达基因。通过BioGRID和ChIP-X程序进行重叠分析，发现ATF3可能是与PARP1合作调控基因表达的转录因子。验证实验显示HG条件下ATF3显著增加，敲低PARP1不仅抑制ATF3 mRNA表达，还减弱其蛋白表达。过表达PARP1导致ATF3表达 concomitant 增加。

免疫荧光分析显示PARP1和ATF3在DKD患者肾组织或HG刺激的足细胞中显著核共定位。同源建模和相互作用位点分析显示PARP1的BRCT结构域(氨基酸385-463)与ATF3(氨基酸4-150)之间存在大量氢键。Co-IP和PLA实验证实了PARP1与ATF3的物理相互作用，且HG刺激增强这种相互作用。重要的是，敲低PARP1或PJ34处理减弱了这种相互作用，并降低了ATF3的PARylation水平，表明PARP1可能通过PARylation影响ATF3功能。

ATF3促进内质网应激、凋亡和足细胞损伤

研究人员发现过表达ATF3可导致IRE1、XBP1s、GRP78、CHOP、BAX和Desmin表达上调，同时抑制BCL2和ZO-1表达。敲低PARP1或PJ34处理可减轻HG诱导的内质网应激、凋亡和损伤，而过表达ATF3可逆转这种效应。流式细胞术也显示凋亡变化。

研究人员进一步探讨ATF3的调控机制。CHIP-X数据库提示ATF3可能调控GRP78的转录。双荧光素酶报告基因实验显示，ATF3野生型质粒转染的足细胞中GRP78启动子活性增强，而ATF3结合位点突变消除这些效应。HG刺激后GRP78启动子活性显著增加，PARP1抑制可降低这种活性。ChIP和qPCR证明HG增强ATF3对GRP78启动子的富集，这种富集可被PARP1敲低或抑制逆转。real-time PCR分析显示，降低PARP1水平或添加PJ34可成功抑制HG诱导的GRP78表达上调，而过表达ATF3增强GRP78表达。

LncRNA 153通过调控PARP1与ATF3的相互作用参与HG诱导的足细胞损伤

研究人员发现过表达lncRNA 153降低了ATF3结合的PARP1蛋白水平，抑制了PARP1介导的ATF3 PARylation。PLA实验进一步证实了lncRNA 153对PARP1与ATF3相互作用的影响。同时，ChIP和qPCR分析表明，过表达PARP1和ATF3显著增加GRP78启动子与ATF3的相互作用，而异位表达lncRNA 153抵消这种效应。real-time PCR显示GRP78 mRNA表达水平显著改变。重要的是，过表达lncRNA 153消除了PARP1和ATF3过表达引起的GRP78启动子活性增强。

此外，lncRNA 153可逆转PARP1或ATF3过表达引起的IRE1、XBP1s、GRP78、CHOP、BAX和Desmin表达升高以及BCL2和ZO-1表达降低，同时减轻凋亡水平。这些结果表明lncRNA 153在PARP1与ATF3的相互作用中起重要作用，影响下游基因表达。

本研究首次发现lncRNA 153在DKD条件下足细胞中表达下调，并导致PARP1表达上调。LncRNA/PARP1轴通过调控内质网应激和凋亡参与高葡萄糖诱导的足细胞损伤。具体机制为lncRNA 153直接结合PARP1，破坏其与ATF3的相互作用，抑制ATF3 PARylation和活性，从而减轻内质网应激和凋亡，缓解DKD中的足细胞损伤。

讨论部分指出，lncRNA作为超过200个核苷酸的非编码RNA，与DKD进展密切相关，有潜力作为诊断生物标志物或治疗靶点。本研究首次报道lncRNA 153在DKD条件下的保护作用，并阐明其通过PARP1-ATF3轴调控内质网应激的新机制。PARP1作为NAD⁺依赖性核蛋白，可通过PARylation修饰调控蛋白功能。研究发现PARP1与ATF3相互作用，并通过PARylation增强ATF3转录活性，进而促进内质网应激相关基因如GRP78的表达。这为理解DKD发病机制提供了新视角。

研究的创新点在于发现了一个新的lncRNA/mRNA调控轴，揭示了PARP1通过PARylation修饰ATF3调控转录活性的新机制，为DKD治疗提供了潜在新靶点。过表达lncRNA 153或阻断PARP1-ATF3相互作用可能成为DKD的潜在治疗策略。这些发现不仅深化了对DKD发病机制的理解，也为开发新的诊断和治疗方法奠定了基础。