过期IDEXX Colilert培养基检测大肠杆菌和总大肠菌群的效能评估：有效期延长至330天的实验室证据

《Discover Bacteria》：Efficacy of expired IDEXX Colilert media in E. coli and coliform detection: a laboratory assessment

本研究针对水质检测中IDEXX Colilert培养基1年有效期造成的成本浪费问题，通过系统评估过期10年内培养基对总大肠菌群、耐热大肠菌群和大肠杆菌（E. coli）的检测效能。结果表明：过期120天内培养基仍保持准确检测能力，E. coli检测甚至可延长至330天。该发现为教育科研领域节约检测成本提供了重要依据，对非监管场景的水质监测具有实践意义。

　　

当我们打开实验室储藏柜，常常会发现一些过期多年的检测试剂静静地躺在角落。对于使用IDEXX Colilert系统进行水质检测的研究人员和教师来说，这种场景尤为熟悉。这种广泛应用于水质微生物检测的培养基，虽然操作简便、结果可靠，但仅有一年的有效期给预算有限的科研教学机构带来了不小的困扰——特别是当检测需求呈现间歇性特征时，比如年度课程实验或周期性野外采样。那么，这些看似"过期"的培养基是否真的失去了检测价值？还是说我们一直在浪费本可继续使用的宝贵资源？

阿拉巴马大学的研究团队在《Discover Bacteria》上发表的最新研究正是为了解决这一实际问题。Sarah Ortbal等研究者系统评估了过期长达10年的IDEXX Colilert培养基对总大肠菌群、耐热（粪便）大肠菌群和大肠杆菌（E. coli）的检测准确性，为科学界提供了关于培养基稳定性的宝贵数据。

研究团队采用的最可能数（MPN）方法是一种基于泊松分布的统计学模型，能够通过97孔板中的阳性/阴性结果数量来估算细菌浓度。他们收集了塔斯卡卢萨污水处理厂的初级出水样本，通过磷酸盐缓冲盐水（PBS）进行梯度稀释，确保样本浓度在可读范围内（<2419.6 MPN/100 mL）。实验设计了严格的对照体系，每个检测批次都包含不同过期时间的培养基与未过期培养基的平行比对，所有培养基均在同一条件下避光保存，最大限度地减少了环境变量对结果的干扰。

检测原理基于两种特异性酶反应：总大肠菌群产生的β-半乳糖苷酶能够代谢邻硝基苯基-β-D-半乳糖吡喃糖苷（ONPG）底物，释放出使溶液变黄的水解分子邻硝基苯酚；而大肠杆菌（E. coli）特有的β-葡萄糖醛酸苷酶则能代谢4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷（MUG）底物，在紫外灯下产生荧光信号。这种双重指示系统使得同时检测总大肠菌群和大肠杆菌（E. coli）成为可能。

关键技术方法包括：样本的系列稀释与平行检测、基于IDEXX Quanti-Tray/2000平台的MPN计数、GNU图像处理程序（GIMP）对颜色饱和度的定量分析、分光光度法验证光学特性（λ=366 nm和λ=597 nm），以及统计学上的Welch t检验（显著性水平p<0.05）。

3.1 过期Colilert的准确性

研究发现，在过期120天内，培养基对总大肠菌群和耐热大肠菌群的检测结果与未过期培养基无显著差异。过期60天的培养基对总大肠菌群的检测结果为未过期培养基的85.6±13.2%（p=0.003），过期120天的为85.8±17.8%（p=0.041）。然而，过期330天及以上的培养基开始出现明显偏差，总大肠菌群结果平均超过未过期培养基的180%（所有p<0.0003），且标准偏差从未过期培养基的17%急剧增加至70-123%。

耐热大肠菌群的检测表现出类似趋势，但稳定性稍好。过期60天的结果为未过期培养基的59.3±8.4%（p<0.001），过期120天的为82.5±19.4%（p=0.025）。值得注意的是，过期330天和790天的培养基结果与未过期培养基无显著差异（p=0.058和p=0.414）。

大肠杆菌（E. coli）的检测表现出不同的模式。过期120天内，35°C和45°C培养条件下的结果与未过期培养基基本一致（94.6-103.5%）。但过期330天后，MPN值开始下降，至过期790天及以上时，结果显著低于未过期培养基（所有p≤0.01）。这种差异可能源于MUG底物的延迟降解，因为延长培养至48小时后，长期过期培养基的结果与未过期培养基趋于一致。

3.2 Colilert的颜色变化

视觉观察和图像分析显示，过期1430天（约4年）以上的培养基出现明显黄化现象。GIMP分析表明，阴性小孔的饱和度值急剧增加至未过期培养基的250-450%（所有p<0.001）。这种变化可能与ONPG酶的非生物降解有关，导致背景黄化加剧，降低了阳性与阴性结果之间的颜色对比度。

分光光度法进一步证实了这一趋势，在597 nm波长处的吸光度与过期时间呈中等强度正相关。相比之下，大肠杆菌（E. coli）荧光检测的亮度值在不同过期时间下保持稳定，表明荧光背景干扰不是主要问题。然而，366 nm波长处的吸光度随过期时间增加而增强，可能与荧光猝灭或降解产物的干扰有关。

3.3 储存温度的影响

初步研究表明，储存条件可能显著影响培养基的长期稳定性。一组过期450天但始终在4°C下保存的培养基，其检测结果与未过期培养基无显著差异（所有p>0.19）。这与室温储存培养基表现出的过度计数（总大肠菌群）和计数不足（大肠杆菌（E. coli））形成鲜明对比，提示冷藏可能有效延长培养基的有效期。

研究结论明确指出，IDEXX Colilert培养基在过期后仍具有一定的使用价值，但适用范围需根据过期时间严格界定。对于非监管场景（如教学实验和探索性研究），过期4个月内的培养基可以替代未过期产品使用，而不会显著影响结果准确性。超过此期限后，总大肠菌群和耐热大肠菌群可能出现假阳性增高，大肠杆菌（E. coli）则可能出现假阴性，导致大肠菌群与大肠杆菌（E. coli）比例异常。

这项研究不仅为预算有限的科研教育机构提供了实用的成本节约方案，也为理解培养基降解机制提供了重要见解。ONPG底物的非生物降解和选择性抑制系统的失效可能是导致假阳性的主要原因，而MUG底物的延迟降解则可能解释大肠杆菌（E. coli）检测灵敏度下降的现象。此外，冷藏储存可能延长培养基有效期的发现，为优化试剂保存条件提供了新的思路。

虽然过期培养基绝不适用于监管要求的合规检测，但对于水质检测教学、方法验证和初步筛查等场景，这项研究无疑为科学合理地利用"过期"资源提供了有力证据，既符合经济原则，也响应了实验室可持续发展的需求。