m6A表观转录修饰主导HOTAIR在EMT中的表观遗传功能

《Cell Death & Disease》：HOTAIR requires epitranscriptomic modification to exert its pivotal epigenetic role in Epithelial to Mesenchymal Transition

本研究聚焦于m6A表观转录修饰对长链非编码RNA HOTAIR功能的调控机制。研究人员通过基因沉默、RNA免疫共沉淀等技术，发现METTL3介导的m6A修饰是HOTAIR与SNAIL/EZH2相互作用并驱动上皮-间质转化（EMT）的关键因素。该研究揭示了表观转录与表观遗传的交叉调控机制，为肿瘤转移治疗提供了新靶点。

在细胞命运决定的过程中，表观遗传调控一直被视为关键机制。然而近年来，科学家们发现RNA层面的化学修饰——表观转录组学，可能对基因表达具有更深层次的调控作用。其中，N6-甲基腺苷（m⁶A）作为真核生物mRNA中最常见的内部修饰，已被证明影响mRNA的成熟、稳定性和翻译效率。但令人困惑的是，这种修饰对长链非编码RNA（lncRNA）功能的调控机制仍是一个未被充分探索的领域。

长链非编码RNA HOTAIR（homeobox transcript antisense intergenic RNA）作为染色质动态和基因调控网络的关键调节因子，在细胞周期调控、代谢、凋亡、自噬、癌变和上皮-间质转化（Epithelial to Mesenchymal Transition, EMT）等多种病理生理过程中发挥重要作用。特别是在EMT过程中，HOTAIR能够与特异性转录因子SNAIL和染色质修饰蛋白EZH2（Polycomb抑制复合物2的催化亚基）相互作用，将这种泛染色质修饰因子特异性地招募到SNAIL靶基因的启动子区域，通过表观遗传重编程驱动其转录抑制。然而，调控HOTAIR与这些蛋白相互作用的分子开关仍然未知。

为了解决这一科学问题，Sabrina Garbo等研究人员开展了一项创新性研究，揭示了m⁶A修饰对HOTAIR功能的决定性影响。他们发现，沉默m⁶A写入酶METTL3能够显著抑制TGFβ处理的上皮细胞和肿瘤细胞的EMT特征，包括形态学改变、迁移和侵袭能力。机制上，HOTAIR在与SNAIL和EZH2相互作用的结构域上发生m⁶A修饰，这种修饰是HOTAIR与SNAIL/EZH2相互作用以及后续HOTAIR依赖性表观遗传抑制的必要条件。破坏m⁶A修饰会阻碍SNAIL/HOTAIR/EZH2三元复合物的组装，从而阻断EMT的完成。

研究团队运用了多项关键技术方法：在细胞模型方面，使用TGFβ诱导的小鼠非肿瘤源性肝细胞和人结直肠癌细胞SW480；在基因操作方面，采用慢病毒介导的METTL3敲降和过表达技术；在分子机制探索方面，通过甲基化RNA免疫共沉淀（meRIP）分析m⁶A修饰位点，交叉连接RNA免疫共沉淀（CLIP）检测RNA-蛋白相互作用，染色质免疫共沉淀（ChIP）分析组蛋白修饰和转录因子结合，同时结合生物信息学预测RNA二级结构；在功能验证方面，采用划痕实验和Transwell侵袭实验评估细胞迁移和侵袭能力。

m⁶A修饰是EMT诱导所必需的

研究发现TGFβ处理通过上调METTL3表达增加m⁶A丰度。METTL3沉默的肝细胞在TGFβ处理后仍保持上皮样形态，上皮标志物E-钙粘蛋白和HNF4α表达恢复，而SNAIL和HOTAIR表达不受影响。类似结果在SW480细胞中得到验证，表明m⁶A修饰对EMT诱导具有普遍必要性。

m⁶A修饰是间质癌细胞特征维持所必需的

在SW480结直肠癌细胞中，METTL3沉默同样引起上皮标志物表达恢复，证实m⁶A修饰在已建立EMT的肿瘤细胞中继续发挥重要作用。

m⁶A修饰是细胞迁移和侵袭能力所必需的

功能实验表明，METTL3沉默显著抑制TGFβ处理的肝细胞和SW480细胞的迁移和侵袭能力，证明m⁶A修饰对EMT相关的细胞行为改变至关重要。

HOTAIR在SNAIL和EZH2结合域发生m⁶A修饰

序列分析发现人和小鼠HOTAIR的SNAIL结合域和EZH2结合域存在多个潜在m⁶A修饰位点。meRIP-qPCR证实这些区域在TGFβ处理的肝细胞和SW480细胞中确实发生m⁶A修饰，且该修饰依赖于METTL3。

m⁶A修饰是HOTAIR-SNAIL和HOTAIR-EZH2相互作用的先决条件

生物信息学预测显示m⁶A修饰影响HOTAIR二级结构。CLIP实验证明METTL3沉默破坏HOTAIR与SNAIL/EZH2的结合。共免疫沉淀实验进一步显示m⁶A修饰是HOTAIR介导SNAIL-EZH2物理相互作用所必需的。

m⁶A是HOTAIR依赖性表观遗传修饰所必需的

ChIP分析显示，METTL3沉默显著降低E-钙粘蛋白和HNF4α启动子区域的H3K27me3富集，但不影响SNAIL与这些启动子的结合，表明m⁶A特异性影响EZH2介导的表观遗传沉默而非SNAIL的DNA结合能力。

这项研究首次揭示了表观转录组学对表观遗传学的上位性调控关系。具体而言，在EMT过程中HOTAIR的表观遗传功能受到m⁶A表观转录修饰的主导性调控。研究结果表明，m⁶A修饰通过改变HOTAIR的二级结构，促进其与SNAIL和EZH2的相互作用，从而驱动三元复合物组装和上皮基因的表观遗传沉默。这一发现不仅深化了对EMT分子机制的理解，更重要的是建立了表观转录与表观遗传之间的直接联系，为肿瘤转移治疗提供了新的策略。针对METTL3-m⁶A-HOTAIR轴的治疗干预可能成为抑制EMT和肿瘤转移的新途径，特别是在肝细胞癌等恶性肿瘤中具有广阔的应用前景。