无需连接剂的量子级纳米金刚石共价DNA功能化

《Advanced Optical Materials》：Linker-Free Covalent DNA Functionalization of Quantum-Grade Nanodiamonds

NV自旋弛豫纳米金刚石表面功能化策略及其生物传感器应用。采用硝基取代和自由基脱羧叠氮化两种方法直接在sp3晶格引入叠氮基团，避免链式连接剂，提升NV中心灵敏度与稳定性。表面反应性测试显示，叠氮化样品与Alexa Fluor 488- alkynes和DNA-修饰寡核苷酸通过点击化学高效结合，最高达640条DNA/ND。NV电荷态和自旋弛豫时间（T1）在叠氮化及点击后均保持稳定，且DNA修饰NDs在22个月内表现出优异的稳定性。研究为NV量子生物传感器开发提供新方法。

　　纳米金刚石（NDs）结合氮空位（NV）中心，已成为生物环境中的强大量子传感器。NV中心的自旋依赖荧光特性使其能够在常温下实时监测自旋相互作用，这一特性赋予了NDs极高的灵敏度和纳米级分辨率。NV自旋弛豫测量技术特别适用于NDs，其依赖于NV中心的自旋-晶格弛豫时间（T1）在数十至数百微秒的范围内，并且可以通过简单的脉冲序列进行，无需微波或射频激发，这使得其在细胞内测量中具有高度的适用性。然而，NV弛豫测量的一个关键限制是其固有的非选择性，因为弛豫率对局部自旋密度的任何波动都非常敏感，从而容易受到各种来源的磁扰动影响，包括由顺磁性离子和自由基引起的扰动。这些物种在生物环境中普遍存在，因此未功能化的ND探针无法直接区分不同来源的弛豫信号。此外，NV弛豫灵敏度随着距离的增加而急剧下降，遵循与距离的六次方成反比的依赖关系，限制了其检测范围仅限于纳米尺度。

为了解决这一问题，研究者们开发了针对ND表面的功能化策略，以屏蔽NV中心与不需要的分子之间的相互作用，同时确保NV自旋对目标分子的特异性。合理设计的功能化可以实现选择性分子结合、调节局部自旋密度，并在ND周围创建定制的微环境。例如，壳层方法如二氧化硅、金和聚合物涂层可以延长NV与分析物之间的距离，从而显著降低灵敏度。而薄涂层如支撑脂质双分子层则增加了约4-5纳米的分离距离。一些研究聚焦于在ND上使用原子级短链接器进行连接，如通过烷基或芳基基团进行点击连接或通过酰胺键形成。尽管这些策略为生物连接提供了概念验证，但它们要么依赖于长度约为0.6-3纳米的链接器，要么导致有限的连接产率。因此，开发一种直接、高产率、无链接器且生物相容性的方法，用于在sp3金刚石晶格上功能化，同时保持最大NV灵敏度，成为重要的研究目标。

DNA检测是ND基量子传感的一个新兴应用。构建序列选择性的DNA阵列对于该技术至关重要。目前，通过非共价的生物素-亲和素结合或通过共价连接到硅化/氮化表面或聚合物上，利用应变促进的氮-乙炔环加成（SPAAC；无铜点击反应）来连接寡核苷酸。尽管这些方法取得了进展，但将核酸高产率地功能化到sp3-C金刚石表面仍然具有挑战性，因为寡核苷酸的负电荷与氧化的ND表面之间存在静电排斥作用。需要注意的是，氧化的表面对于稳定NV?电荷状态（用于T1读出）是优选的。虽然非特异性、静电驱动的吸附作用在阳离子化的ND上容易发生，但将DNA特异性锚定到带负电的金刚石表面则需要化学选择性和高效的方法。

本研究报告了一种灵活的ND表面活化策略，使构建无链接器的DNA基量子探针成为可能。为了最小化DNA与表面之间的距离，DNA分子直接共价连接到高压力高温（HPHT）ND的sp3碳金刚石晶格上。首先，我们通过生物正交反应在ND表面安装氮杂化基团，然后利用点击化学的快速反应动力学和高产率进行连接。比较了两种互补的氮化方法：i）溴化表面的亲核取代与N??反应；ii）空气氧化和三酸氧化的ND通过自由基脱羧氮化反应进行氮化。氮化过程通过傅里叶变换红外光谱（FTIR）、X射线光电子能谱（XPS）和元素分析进行分析。氮化基团的反应性通过与荧光染料和带有钆标记的寡核苷酸的连接进行基准测试，使用SPAAC与二苯并环辛烯（DBCO）修饰的DNA进行反应。温和的SPAAC条件防止了DNA的氧化和水解损伤，并且较长的反应窗口使得高耦合产率和定义的DNA取向成为可能。最后，我们评估了表面氮化和由此产生的三唑对NV光学和量子性质的影响，包括单粒子和群体水平。

两种不同的氮化策略被系统测试以优化ND的功能化。为了避免sp2-C化学和引入延长NV到氮化基团距离的链接器，我们采取了一种直接方法，即针对sp3碳金刚石晶格进行反应。首先，我们使用亲核取代，将溴化的、空气氧化的ND转化为氮化终止的粒子，在温和、无水条件下进行。其次，我们采用自由基脱羧氮化反应，在富含羧酸的三酸氧化ND中使用对甲苯磺酰氮化物（TsN?）与银离子和过硫酸钾引发剂进行反应。该途径选择性地将表面羧酸替换为氮化物，并可能提供更高的可及性和反应性。通过比较这两种互补的方法，我们寻求在保持NV电荷和自旋性质的同时，找到最适合直接共价连接生物分子的表面。

亲核氮化开始于带有主要羟基、可能的醚和少量羧酸的空气氧化ND（图1A）。首先，使用硫酰溴（SOBr?）在吡啶催化下将表面羟基转化为溴化物，然后在无水N,N-二甲基乙酰胺（DMAC）中用氮化物盐（LiN?、NaN?和(Bu?N)N?）进行亲核取代，得到氮化终止的ND（AZID_X，其中X = Li、Bu?N、Na）。需要注意的是，由于表面溴化物对水分敏感且易水解，因此严格无水条件是必要的。在惰性条件和非质子溶剂中，这些溴化物保持稳定，并可重复地转化为氮化物。DMAC维持了溴化ND的稳定胶体分散，确保了功能化的均匀性。

我们随后研究了反离子对取代效率的影响，选择了锂（LiN?）、钠（NaN?）和四丁基铵（(Bu?N)N?）氮化物，因为它们在DMAC中的溶解度适中（样品AZID_Li、AZID_Na和AZID_Bu4N）。其中，四丁基铵氮化物表现出最高的溶解度，其次是锂和钠氮化物（表S1，补充信息）。我们没有使用更高价的碱金属，因为它们的氮化物在DMAC中溶解度较低。

反应后，所得ND被彻底洗涤、分离并用FTIR光谱、元素分析和XPS进行表征。与溶解度预期相反，锂氮化物在FTIR光谱中产生了最强烈的氮化物吸收带，在2133 cm?1处出现（图1B）。其他氮化物则导致最小或无法检测到的FTIR信号（图S1，补充信息）。元素分析证实了成功终止，将空气氧化前的氮含量从0.07 ± 0.07 wt%提高到AZID_Li样品的0.42 ± 0.06 wt%（表1）。XPS未检测到显著的N 1s特征（图S2，补充信息），因为氮化物表面密度低于约0.1 at.%的检测阈值。然而，解卷积的C 1s光谱（图S3，补充信息）证实了在所有功能化步骤后，sp3碳成分仍占主导地位，其中可识别的C-N?共价键信号支持了所有样品的直接氮化修饰。

接下来，我们研究了表面氮化物对炔基环加成反应的反应性。进行了两种模型环加成反应：铜催化的氮-炔基环加成（CuAAC）与AF488-炔基荧光探针反应，以及无金属的应变促进氮-炔基环加成（SPAAC）与DBCO-PEG?-COOH修饰的DNA进行反应。CuAAC因其优异的化学选择性、广泛的合成应用和快速的反应动力学而被选择。它适合于耐受高离子强度的小分子，并且不含能与Cu(I)配位的功能基团。相比之下，SPAAC反应在温和、无金属的条件下进行，使其特别适用于生物分子的连接，尤其是在寡核苷酸连接中，金属离子可能引起降解。在大量洗涤后，荧光探针允许简单的光谱定量，而钆标记则通过电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）进行精确的无干扰分析。此外，延长的反应窗口提供了高耦合产率和定义的DNA取向。最后，我们评估了表面氮化和由此产生的三唑对NV光学和量子性质的影响，包括单粒子和群体水平。

为了量化这一影响，我们使用MATLAB中的非负矩阵分解对NV光谱进行了光谱解卷积，如前所述。从图S9（补充信息）中获得的两个分数，分别对应于NV?和NV?光谱，然后用于拟合测量数据并计算每个样品的NV?/NV?光谱比（图3C）。在3ACID和AZID_DEC样品中，NV?/NV?光谱比的分布，在扩散度和中位数方面是可比较的。AZID_DEC-Click样品表现出更窄的分布和一致更高的NV?/NV?光谱比，这我们归因于DBCO-PEG?-COOH基团的负电荷。AZID_DEC-Click样品增强的NV?发射与使用650 nm长通滤波器测量时的更高光谱计数相一致（图3D）。同样，与单粒子结果一致，AZID_DEC-Click样品在胶体光谱测量中表现出更高的光谱强度和更强的NV?发射（图3E）。需要注意的是，所有样品的浓度相同（如补充信息所示），并且所绘制的光谱未进行归一化。

最后，我们进行了全光学（即无需微波激发）的T?弛豫测量，以评估单粒子水平的NV性能。为了在弛豫序列期间最小化NV的离子化和复合过程，我们使用了非常低的激光功率（减少激光诱导的电荷效应）并仅考虑没有明显电荷相关衰减的测量数据。T?分布表明，在氮化后，弛豫常数略有减少，但在点击反应后完全恢复甚至有所延长（图3F）。这些结果证实了直接氮化能够实现生物正交连接，同时保持或提高NV中心的量子传感性能。

通过这两种互补的方法，我们成功实现了ND表面的稳定氮化，且未检测到ND晶格的降解。在空气氧化的ND中，使用锂氮化物的样品在FTIR光谱中表现出最强烈的氮化物吸收带，而三酸氧化的ND则通过自由基脱羧氮化反应进行氮化，尽管其氮含量仅为锂氮化物的一半，但其表现出更高的连接效率。这表明通过自由基脱羧氮化引入的氮化物具有更高的反应性，可能由于更好的立体可及性。而使用钠和四丁基铵氮化物的样品表现出显著较低的反应性，这与它们较弱的FTIR氮化物信号和较低的氮含量相一致。在AZID_DEC-Click样品中观察到的显著降低的ζ电位，可能是由于引入了立体较大且电荷较低的DNA分子，这些分子可能取代了反离子并使滑移平面向外移动，从而降低了ζ电位的测量值。通过改变温度并采用冻融循环进一步优化了SPAAC反应条件（见图S6，补充信息）。尽管加热在DMSO中实现了最高的结合效率（高达约640个寡核苷酸每ND），但需要孵育长达7天。相比之下，冻融协议在24小时内实现了约400条DNA链的结合。根据应用和目标分子的热稳定性，可以选择加热或冻融方法以实现ND的高效DNA功能化。

所有的氮化和DNA连接的ND样品在动态光散射（DLS）和ζ电位（ZP）测试中均表现出良好的胶体稳定性（图S7，补充信息）。所有样品的ζ电位集中在约-40 mV，与初始的AIR样品相似（表1）。这表明氮化保持了ND表面的整体静电特性，确保了与进一步功能化策略和生物应用的兼容性。透射电子显微镜（TEM）分析显示，在氮化后，平均粒子尺寸略有增加，圆形度略有下降，这可能是由于在纯化过程中丢失了非常小的颗粒，但未发现晶格蚀刻或降解的证据（图S4，补充信息）。

此外，通过非负矩阵分解（在MATLAB中进行）对NV光谱进行解卷积，我们得到了各个样品的NV?/NV?光谱比（图3C）。3ACID和AZID_DEC样品的分布，在扩散度和中位数方面是可比较的。AZID_DEC-Click样品表现出更窄的分布和一致更高的NV?/NV?光谱比，这可能归因于DBCO-PEG?-COOH基团的负电荷。在使用650 nm长通滤波器测量时，AZID_DEC-Click样品的增强NV?发射与更高的光谱计数相一致（图3D）。同样，与单粒子结果一致，AZID_DEC-Click样品在胶体光谱测量中表现出更高的光谱强度和更强的NV?发射（图3E）。需要注意的是，所有样品的浓度相同（如补充信息所示），并且所绘制的光谱未进行归一化。

为了进一步验证NV?电荷稳定性和自旋-晶格T?弛豫时间在点击反应后的保持情况，我们进行了全光学的T?弛豫测量（图3F）。这些测量表明，点击反应后，T?弛豫时间不仅恢复，而且有所延长，这表明直接氮化能够实现生物正交连接，同时保持或提高NV中心的量子传感性能。

综上所述，通过直接在ND表面引入氮化物基团，为寡核苷酸与sp3金刚石晶格的共价连接提供了一种可行的解决方案。本研究中采用的两种方法——亲核取代和自由基脱羧氮化——均实现了稳定的氮化功能化，且未检测到ND晶格的降解。在亲核取代中，锂氮化物在FTIR光谱中表现出最强烈的氮化物吸收带，而在自由基脱羧氮化中，尽管其氮含量仅为锂氮化物的一半，但其表现出更高的点击反应效率。我们归因于自由基脱羧氮化方法中羧酸基团（作为氮化物的前体）的更好可及性。此外，我们还展示了在最佳反应条件下，通过加热方法，可以将约640个寡核苷酸共价连接到每个ND上，这比最佳的冻融方法高约40%。重要的是，NV?电荷稳定性和自旋-晶格T?弛豫时间在与寡核苷酸的点击反应后得以保持，这对于开发具有选择性的ND探针以实现分子传感是理想的。我们进一步证明，这些DNA连接的ND在无RNase的水中储存22个月后仍保持胶体和化学稳定性。基于点击化学的普遍性，我们相信该方法可以很容易地应用于寡核苷酸以外的分子和大分子的共价连接，包括蛋白质、肽、适配体和一般聚合物。考虑到类似的sp3碳表面化学可以从HPHT ND转移到化学气相沉积（CVD）金刚石，我们预计本研究中提出的无链接器策略将对高特异性NV基量子生物传感器的设计具有广泛的用途。