定向扩增调节性T细胞以在肾移植后诱导免疫耐受

《Advanced Science》：Targeted Expansion of Treg Cells to Induce Immune Tolerance after Kidney Transplantation

肾移植术后通过靶向CD248的纳米颗粒（tNPs）诱导肾特异性调节性T细胞（Treg）扩张，显著延长移植物存活时间，改善肾功能并减少补体沉积。tNPs结合CD248抗体（IgG78）和肾特异性NPHS2启动子驱动IL-2/TGF-β表达，精准定位于肾间质细胞并维持长期功能。动物实验证实，术前联合术后tNPs治疗可增强Treg细胞浸润，抑制急性排斥并缓解慢性纤维化。机制研究揭示CD248通过HIF-1α/IL-1β信号通路调控，纳米载体膜包裹技术延长循环半衰期并增强靶向性。该策略为减少系统性免疫抑制提供了新范式。

　　肾移植仍然是治疗终末阶段肾病（终末肾病的一种治疗手段），但仍然面临诸如器官短缺和由于全身免疫抑制而引发的感染风险等挑战。细胞疗法被寄予厚望，可能替代免疫抑制药物。然而，尽管调节性T细胞（Treg细胞）疗法可以减轻免疫排斥反应，但它无法显著延长移植物的存活时间，因为外周诱导的Treg细胞在循环系统中表现出转分化能力。近年来，纳米载体系统的进步为实现移植物特异性免疫耐受提供了有希望的途径。通过单细胞测序分析，CD248被鉴定为肾移植排斥反应中一种关键的基质细胞标志物，其表达受到H IF-1α和IL-1β信号通路的调控。利用巨噬细胞膜包被技术，开发了一种同时携带IL-2和TGF-β表达质粒的纳米颗粒。这些纳米颗粒整合了针对CD248的抗体（IgG78）和包含肾特异性NPHS2启动子的质粒，从而实现了对局部基因表达的双重靶向能力。体外验证显示，CD4?T细胞在这些纳米颗粒的作用下能够高效地分化为功能性的Treg细胞群体。在大鼠肾移植模型中，纳米颗粒治疗显著增加了移植物中的Treg细胞数量，延长了移植物存活时间，改善了肾功能，并减轻了补体沉积。这些发现确立了一种靶向纳米颗粒平台，通过局部Treg细胞扩增促进移植物特异性免疫耐受，有望减少对全身免疫抑制的依赖。

肾移植在改善终末阶段肾病患者生活质量方面具有重要意义。与透析相比，肾移植能够显著提升患者的生活质量。然而，尽管肾移植是终末阶段肾病的标准治疗方法，但由于伦理法律复杂性和社会宗教因素的限制，器官短缺仍然制约了肾移植的发展。因此，延长移植物的存活时间对肾移植患者至关重要。当前的标准免疫抑制方案包括他克莫司、霉酚酸酯和糖皮质激素的联合使用，虽然能有效预防急性排斥反应，但其狭窄的治疗窗口反而增加了病毒感染期间（如流感和新冠）的感染风险，并通过钙调神经抑制剂毒性导致肾功能的逐渐恶化。值得注意的是，大多数长期移植物失败是由于慢性排斥反应，即使免疫抑制足够，这也凸显了开发能够减少全身药物暴露的耐受诱导疗法的迫切需求。

为了维持移植物的稳态，需要对移植物内的免疫细胞动态进行精准调控。调节性T细胞在维持外周耐受和促进组织修复方面发挥着双重作用。临床试验表明，Treg细胞疗法可以显著降低患者的感染风险，但并未延长移植物的存活时间。虽然IL-2和TGF-β的联合刺激可以在体外从CD4?T细胞中生成Treg细胞，但在临床转化过程中，由于体外培养条件与体内生理环境的差异，导致Treg细胞在回输后迅速退化。这种退化现象源于微环境差异，表明需要开发一种能够实现局部Treg细胞扩增的策略。

新兴的纳米技术为实现空间免疫调节提供了新的解决方案。选择合适的靶点是实现移植物内Treg细胞特异性扩增的第一步。研究发现，CD248是一种在基质细胞（包括肾小球细胞和成纤维细胞）中特异性表达的单跨膜糖蛋白。目前的研究表明，CD248与组织纤维化和免疫细胞浸润有关，但其在移植中的作用仍缺乏系统研究。我们的研究发现，CD248在肾移植后显著上调，这使其成为理想的靶点。我们研究团队之前已经开发了一种针对CD248的特异性抗体IgG78。此外，使用细胞膜包被纳米颗粒的生物模拟策略是一种相对成熟的方法，能够提高生物利用度。

在本研究中，我们开发了一种双重靶向的纳米颗粒平台，通过CD248特异性结合实现对移植物基质细胞的精准定位，同时利用肾特异性启动子（NPHS2）驱动局部IL-2/TGF-β的表达。这种策略实现了三个治疗目标：1）精准靶向移植物，诱导Treg细胞分化，避免全身细胞因子暴露；2）减少对肾毒性钙调神经抑制剂的依赖；3）通过部分释放免疫系统，保留抗微生物免疫能力——这是传统免疫抑制方法所无法实现的重要优势。

在体外实验中，我们系统评估了这些纳米颗粒的Treg诱导能力。通过qPCR、WB和ELISA的组合分析，只有这些纳米颗粒能够实现治疗性细胞因子的产生。在我们优化的CD4?T细胞与基质细胞共培养系统中（药理学相关的他克莫司浓度以维持基质细胞活性；图S4B，支持信息），功能性的纳米颗粒显著增强了Treg细胞的诱导（CD4?Foxp3?），相较于单一成分制剂（图4D–F）。这种诱导效应具有时间依赖性（48至96小时），与经典的细胞因子驱动的Treg分化模式相一致（图S5A,B，支持信息）。为了研究诱导Treg细胞（i-Treg）的功能特性，我们进行了多组共培养实验。首先，i-Treg细胞在与CD8?T细胞共培养时表现出显著的免疫抑制作用，这体现在PD1?CD8?耗竭T细胞数量的增加（图4G）以及通过CFSE染色确认T细胞增殖被抑制（图4H）。其次，在与内皮细胞（HUVECs）共培养的系统中，培养上清液的蛋白质组分析显示i-Treg细胞显著分泌IL-4（图4I）。内皮细胞的转录组分析显示HMGB1和XBP1的表达上调（图S6A,B，支持信息），随后的通路分析显示IL-4相关信号通路以及MAPK和AKT通路的激活（图4J–M）。值得注意的是，这些发现与已有证据一致，表明IL-4在移植中的作用复杂，它既能促进组织修复，也可能在某些情况下加剧排斥反应。

在体内实验中，我们验证了纳米颗粒的治疗潜力。我们建立了大鼠单侧同种肾移植模型，使用Wistar大鼠作为供体，Sprague-Dawley（SD）大鼠作为受体（图5A）。纳米颗粒治疗显著延长了移植物的存活时间，并成功提高了移植物中的IL-2和TGF-β含量（图5B–D）。肾功能的维持通过血清肌酐和血尿素氮水平的保持得到了验证（图5E,F）。组织病理学分析显示，纳米颗粒处理的移植物中肾组织结构得以保留，补体C3d沉积减少，IL-2/TGF-β水平上升（图5G）。增强的免疫耐受通过移植物内Treg细胞频率的增加得到了证明（图5H）。为了验证Treg细胞的依赖性，我们使用反义寡核苷酸（ASO）预处理抑制Foxp3表达（图5I）。这种抑制完全抵消了纳米颗粒带来的生存优势（图5J）。虽然TGF-β和IL-2水平仍然升高，但在ASO处理的受体中，Treg细胞的恢复能力受损（图5K–N）。同时，组织病理学的恶化进一步确认了Treg细胞的依赖性（图5P）。这些结果表明，纳米颗粒通过Treg细胞介导的免疫耐受机制延长了移植物的存活时间。

我们的纳米治疗平台通过空间控制的免疫调节解决了这些挑战。开发的双重靶向纳米颗粒系统通过基质细胞特异性CD248的结合和肾实质限制的转基因表达（NPHS2启动子）实现了Treg细胞的局部扩增。这种空间精确性解决了两个历史难题：1）传统IL-2/TGF-β疗法带来的全身细胞因子毒性；2）采用性转移的Treg细胞功能不稳定性（≤40%的存活率在移植后1个月内）。关键的是，局部Treg细胞极化在治疗动物中保留了抗微生物免疫能力——这是当前免疫抑制组合的一个重要限制。

这项研究带来了三个具有变革意义的创新。首先，我们通过单细胞图谱驱动的方法发现CD248是肾移植排斥反应中一种机械响应的基质决定因素，其表达受到HIF-1α和IL-1β信号通路共同调控，解释了其在微环境中的特异性。其次，生物模拟的巨噬细胞膜包被纳米颗粒与NPHS2驱动的表达相结合，实现了更高的肾组织积累率，相较于非靶向纳米颗粒。第三，我们不仅发现了Treg细胞在排斥反应中的抑制作用，还揭示了其在血管修复中的作用——这是一种广谱机制，调和了历史上关于IL-4在移植中的矛盾观点。

IL-4是一种Th2型细胞因子，通常被认为具有抗炎和免疫调节作用。然而，其在肾移植中的作用是复杂的。IL-4可以促进B细胞向浆细胞的分化，从而产生供体特异性抗体（DSA），这可能增加排斥反应的风险。然而，IL-4也有诱导免疫耐受的潜力。一些研究表明，IL-4可以促进Treg细胞分化和功能，抑制Th1型免疫反应，并减少急性排斥反应的发生。此外，IL-4可能调节树突状细胞（DC）的功能，从而促进长期移植物存活。IL-4还能促进血管生成和重塑。在我们的研究中，我们发现IL-4激活了内皮细胞中的多种信号通路，参与了血管修复过程。综上所述，IL-4在肾移植后的具体作用仍需进一步研究，但我们的研究进一步强调了这种细胞因子在移植后的关键作用。

不可避免的是，这项研究仍然存在一定的局限性。首先，当前的实验主要基于啮齿类动物模型，其免疫微环境与人类存在差异，因此需要进一步在非人灵长类动物中进行验证。对大型动物的长期治疗实验可能会产生更有说服力的数据。其次，纳米颗粒的长期生物安全性（如代谢途径和潜在的免疫原性）尚未完全阐明，需要系统评估慢性毒性。此外，临床转化还需要解决大规模生产过程、成本控制和个体化给药方案的优化问题。未来的研究可以探索将该策略与其他免疫调节疗法（如检查点激动剂或CAR_Treg技术）结合，以进一步提高治疗效果。

总之，本研究提供了一种诱导肾移植后免疫耐受的新方法，具有精准和安全的特点。它有望推动临床实践从“广谱免疫抑制”向“局部免疫调节”转变，为终末阶段肾病患者开辟了一条实现长期移植物存活和改善生活质量的新途径。