综述：靶向胆管癌肿瘤微环境以改善免疫检查点阻断的潜力策略与转化临床前模型

《Clinical & Translational Immunology》：Targeting the tumor microenvironment in cholangiocarcinoma to improve immune checkpoint blockade: potential strategies and translational pre-clinical models

本综述系统探讨了胆管癌（CCA）这一临床需求迫切的恶性肿瘤的免疫治疗新策略。文章重点分析了免疫抑制性肿瘤微环境（TME）特征，包括癌症相关成纤维细胞（CAFs）、髓源性抑制细胞（MDSCs）、肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）等如何导致免疫“冷”表型及对免疫检查点抑制剂（ICIs）的耐药性，并评述了靶向TME、细胞因子信号（如TGF-β）、免疫激活（如CD40/STING激动剂）及过继性细胞疗法等联合策略的潜力。同时，文章深入评估了具有完整免疫环境的转化临床前模型（如人源精密组织切片hPCTS）在推动个体化治疗开发中的关键作用。

　　

Abstract

胆管癌（Cholangiocarcinoma, CCA）是一种临床需求远未得到满足的恶性肿瘤，治疗选择有限。大多数患者确诊时已处于晚期或转移阶段，无法进行以治愈为目的的手术切除。吉西他滨-顺铂化疗一直是这些患者的标准治疗方案，十余年来未曾改变。近期，一项III期临床试验表明，在该方案中加入程序性死亡配体1（PD-L1）抑制剂度伐利尤单抗（durvalumab）后，客观缓解率（ORR）达到26.7%，成为晚期胆管癌的新标准治疗。尽管这被认为是胆管癌治疗的成功，但结果也表明仅有小部分患者对免疫检查点抑制剂治疗有反应。新出现的证据表明，许多胆管癌肿瘤呈现出免疫学上的“冷”肿瘤微环境，其特征是免疫抑制性免疫细胞群占主导，而细胞毒性T细胞浸润有限，这导致了其对免疫检查点抑制剂的耐药性。本综述全面概述了在胆管癌中应用免疫调节策略的研究，这些策略旨在启动肿瘤微环境，使其对免疫检查点抑制剂产生更有效的反应。本文还将评估当前胆管癌临床前模型的优势与局限性，重点关注更先进的转化模型。这些复杂模型仍未得到充分利用，阻碍了新治疗方法的开发。我们认为，这些复杂的临床前模型可能有助于将疗法转化为临床实践。

Introduction

胆管癌（CCA）是一种侵袭性胆道腺癌，根据解剖起源分为三组：肝内胆管癌（iCCA）、肝门周围胆管癌（pCCA）和远端胆管癌（dCCA）。iCCA起源于二级胆管周围，而pCCA和dCCA（合称为肝外胆管癌，eCCA）分别起源于左、右或肝总管以及胆总管。尽管只有iCCA在解剖学上被定义为原发性肝癌，但许多流行病学研究将所有CCA亚型归为一类，统称为仅次于肝细胞癌（HCC）的第二大常见原发性肝癌，约占病例的15%。这种更广泛的分类现在被认为是过时的，因为肝内和肝外亚型之间出现了新的区别。这些进展促使世界卫生组织在国际疾病分类第11版中采用了三亚型CCA分类。

全球CCA，特别是iCCA的发病率和死亡率近年来有所上升。虽然发病率和死亡率因地区而异，东亚地区的iCCA发病率最高，但西方国家也出现了令人担忧的增长趋势。值得注意的是，英国国家疾病登记服务处的“Get Data Out”项目数据显示，2022年CCA的诊断数量几乎与HCC持平，凸显了加强CCA研究以应对这一日益增长的健康负担的迫切性。尽管关注度日益提高，CCA仍然是一种临床需求远未得到满足的癌症，其发病率上升和晚期或不可切除病例的5年总生存期（OS）仅为7-20%就证明了这一点。

本综述全面更新了CCA治疗的最新进展，重点关注免疫疗法和作为治疗反应关键决定因素的肿瘤微环境（TME）。我们讨论了旨在提高免疫疗法疗效的关键研究工作，强调需要更多具有转化相关性的临床前模型来研究CCA TME动态，并探讨这些模型如何指导开发更有效的治疗组合。我们概述了改善免疫治疗结果的未来方向，并指出了值得进一步研究的关键转化差距。

Advances in cholangiocarcinoma chemo-immunotherapy

目前，CCA唯一可能治愈的治疗方法是根治性手术切除；然而，高达80%的患者就诊时已为不可切除或转移性疾病。即使手术后，复发率仍然很高，在大多数系列研究中，5年OS仅为20-40%。因此，人们探索了各种辅助治疗方式以改善术后生存。

自2017年以来，三项随机III期试验评估了辅助化疗对患者结局的影响，结果不一。BCAT研究将切除后的CCA患者随机分组至观察组或吉西他滨组，发现两组间生存概率无显著差异。同样，PRODIGE12-ACCORD18试验评估了吉西他滨-奥沙利铂在切除后CCA患者中的应用，报告显示治疗组和观察组在无复发生存期（RFS）和OS方面无显著差异。相比之下，BILCAP试验在符合方案人群中显示，辅助卡培他滨显著改善了OS和RFS，OS具有临床意义的获益，达14.7个月。基于这些结果，美国临床肿瘤学会推荐切除后接受6个月的辅助卡培他滨作为CCA的标准护理。

对于不可切除或转移性CCA患者，联合化疗仍然是主要治疗手段，同时也有针对靶向分子疗法和免疫疗法的试验。ABC-02 III期试验在410名晚期CCA、胆囊癌或壶腹癌患者中比较了吉西他滨-顺铂与吉西他滨单药治疗。双重化疗将中位OS延长了3.6个月，无进展生存期延长了3个月。尽管中位OS仍低于1年，但这在当时是一个重大进步，导致吉西他滨-顺铂被确立为晚期CCA的一线治疗，直至2024年初仍为英国国家卫生与临床优化研究所（NICE）指南所推荐。不可切除CCA的标准护理超过10年未曾改变。

CCAs表现出免疫原性特征，包括在TME中表达免疫检查点分子，如程序性死亡配体1（PD-L1）和细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4（CTLA-4）。化疗已被证明具有免疫调节作用，可能增强抗肿瘤免疫。这些观察结果为将免疫检查点抑制剂（ICIs）与标准化疗联合使用以改善患者结局提供了理论依据。

一项评估度伐利尤单抗（PD-L1抑制剂）联合吉西他滨-顺铂的II期试验显示，ORR达72%，中位OS为20.2个月，且无剂量限制性毒性，为该方法提供了概念验证。这导致了TOPAZ-1 III期试验，该试验在685名晚期CCA患者中评估了度伐利尤单抗联合吉西他滨-顺铂与安慰剂联合吉西他滨-顺铂的疗效。与单纯化疗相比，度伐利尤单抗显著改善了OS（12.8个月 vs. 11.5个月）和ORR（26.7% vs. 18.7%）。因此，吉西他滨-顺铂-度伐利尤单抗成为晚期CCA的新一线治疗，取代了NICE指南中单纯化疗的地位。然而， modest的ORR突显出仅有小部分患者获得有意义的临床获益，强调了我们在理解ICI反应预测因子和耐药机制方面存在重要空白。

KEYNOTE-966 III期试验评估了程序性死亡1（PD-1）抑制剂帕博利珠单抗（pembrolizumab）联合吉西他滨-顺铂在1069名不可切除CCA患者中的效果。帕博利珠单抗组的中位OS比单纯化疗组获益1.8个月。作者得出结论，鉴于OS有统计学意义的改善和可接受的安全性，帕博利珠单抗联合吉西他滨-顺铂代表了先前未经治疗的转移性或不可切除CCA的一种可行治疗选择。然而，NICE尚未更新指南将帕博利珠单抗纳入晚期CCA治疗，其常规使用仍存在不确定性。

ICI疗法革新了肿瘤学，在某些患者中显示出卓越疗效，并推动了患者分层和肿瘤免疫学理解的进步。然而，许多肿瘤，包括CCA，表现出对ICI的耐药性。提出的机制包括肿瘤内在因素、多种免疫检查点共表达、病因依赖性机制、宿主因素和各种代谢物。TME在整个治疗过程中调节抗肿瘤免疫反应中起着核心作用，是患者对ICI反应的关键决定因素。

Tumor microenvironment of cholangiocarcinoma

CCA的TME以高度纤维化的间质和丰富的免疫抑制性免疫细胞为特征。癌症相关成纤维细胞（CAFs）及其产生的细胞外基质（ECM）与各种细胞类型相互作用，影响肿瘤生长、营养供应、免疫调节并提供免疫屏障。持续活化的CAFs分泌肿瘤促进性细胞因子，如转化生长因子-β（TGF-β）、血小板衍生生长因子和胰岛素样生长因子I/II，这些因子促进肿瘤增殖、免疫逃逸和抗凋亡。CCA中肿瘤CAF水平高与预后不良相关。CCA TME中高度浸润免疫抑制性髓系细胞，特别是髓源性抑制细胞（MDSCs）、肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）、肿瘤相关中性粒细胞（TANs）和调节性T细胞（Tregs）；因此，抗肿瘤免疫反应受到抑制。

Pro-tumor immunity in CCA

TAMs，主要表现出M2样表型，在CCA中含量丰富，并促进肿瘤生长、血管生成、上皮-间质转化和免疫抑制。CCA肿瘤细胞通过细胞因子如IL-6和TGF-β，通过IL-6/STAT3通路驱动M2极化。TAMs分泌免疫抑制因子，包括白细胞介素-10（IL-10）、血管内皮生长因子（VEGF）、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）以及趋化因子如CCL17和CCL22，这些因子招募Tregs、MDSCs和TANs到TME。它们还产生Wnt配体（Wnt3a和Wnt7b），通过经典Wnt信号支持肿瘤增殖。在iCCA和eCCA中，TAM密度与肿瘤分级、微血管密度和肝外转移相关。尝试靶向TAMs，例如阻断集落刺激因子1受体（CSF1R），由于通过趋化因子（C-X-C基序）配体（CXCL）2补偿性浸润MDSCs，从而维持免疫抑制，效果有限。

MDSCs进一步放大免疫抑制，尽管其在CCA中的表型和招募机制尚不明确。肿瘤衍生的GM-CSF、IL-6和VEGF-A吸引MDSCs，后者通过TGF-β、IL-10、精氨酸酶（ARG）-1和活性氧抑制T细胞反应。

TANs表现出功能可塑性，采用促肿瘤（N2）或抗肿瘤（N1）表型。TGF-β促进N2极化，增强肿瘤进展。CCA细胞分泌的CXCL5介导了TAN的招募，激活PI3K–Akt和ERK1/2–MAPK通路以支持肿瘤生长和转移。在iCCA和eCCA中，TAN浸润与OS降低相关。TANs和TAMs进行相互交流；TAN衍生的IL-1β刺激TAMs，而TAMs释放IL-11和制瘤素M，增强TAN介导的肿瘤生长。在eCCA中，高TAN水平与Treg浸润增加和CD8⁺ T细胞减少相关，有助于形成免疫抑制性TME。

Tregs，特别是Foxhead box P3（FOXP3）⁺亚群，导致T细胞功能障碍。高FOXP3⁺:CD8⁺ T细胞比率预示OS降低。肿瘤衍生的IL-2和TGF-β将CD4⁺CD25^?细胞转化为Tregs。Tregs抑制CD8⁺ T细胞，并与较差的预后和淋巴转移相关，特别是在eCCA中，即使在切除后也是如此。FOXP3下调可减少肿瘤增殖、侵袭和免疫抑制性细胞因子信号传导，表明其在肿瘤进展和免疫逃逸中具有功能性作用。Tregs抑制CD8⁺ T细胞、自然杀伤（NK）细胞和树突状细胞（DCs），建立了一个免疫许可的生态位。

Antitumor immunity in CCA

NK细胞虽然在肝脏中含量丰富，能够通过颗粒酶B、FasL和TNF-α介导细胞毒性，但由于杀伤细胞免疫球蛋白样受体和人类白细胞抗原基因位点的改变，在CCA患者中常常功能受损。肿瘤诱导的应激配体MICA/B的脱落阻断了NKG2D介导的肿瘤识别，进一步限制了NK细胞功能。然而，肿瘤内高CXCL9表达促进NK细胞浸润，并与改善的结局相关。临床前研究表明，过继转移扩增或活化的NK细胞可抑制肿瘤生长，特别是与西妥昔单抗等单克隆抗体联合使用时。中和抗体针对可溶性MICA/B可在与CCA细胞共培养时恢复NK细胞的脱颗粒和IFN-γ产生。

DCs是抗原呈递细胞，通过加工并将肿瘤相关抗原呈递给初始T细胞来启动适应性免疫。在CCA中，成熟的CD83⁺ DCs通常与CD4⁺和CD8⁺ T细胞一起出现在肿瘤外围，表明其在连接先天性和适应性免疫反应中起作用，尽管其外周定位可能反映了免疫排斥。成熟的DC浸润增加与更好的预后和更少的淋巴结转移相关。然而，肿瘤衍生的TGF-β和IL-10损害DC的成熟和功能，减少T细胞活化。工程化的单核细胞来源的DCs在体外增强CD8⁺ T细胞的细胞毒性，促炎性DCs在CCA中促进Th1反应和肿瘤特异性细胞毒性。尽管如此，DCs的双重免疫刺激和免疫抑制功能使其在CCA中的临床应用复杂化。

黏膜相关恒定T（MAIT）细胞通常存在于肝组织中，也影响CCA预后。肝MAIT细胞水平较高的患者显示出改善的OS，表明其具有保护作用。CD4⁺ T辅助（Th）细胞在CCA中协调适应性免疫反应，特别是在肿瘤边界，它们在那里支持B细胞活性。Th细胞分化为具有不同细胞因子谱的亚群：Th1细胞产生IFN-γ和IL-2，促进细胞毒性免疫；Th2细胞分泌IL-4、IL-5和IL-13，有助于体液反应；Th17细胞产生IL-17和IL-22，根据上下文环境可能促进或抑制肿瘤。在一个病例中，过继转移突变特异性Th1细胞稳定了转移性CCA病灶，突出了Th细胞的治疗潜力。

CD8⁺ T细胞是CCA适应性抗肿瘤免疫的核心，通过穿孔素、颗粒酶B、FasL和TNF-α执行细胞毒性。一项研究中，超过50%的切除CCAs显示有CD8⁺肿瘤浸润淋巴细胞（TILs），其中约30%表达颗粒酶B，表明具有功能活性。高颗粒酶B⁺ CD8⁺ T细胞密度与iCCA和dCCA的OS改善相关。Sabbatino等人报告称，纤维隔中的CD8⁺ T细胞浸润显著多于肿瘤小叶。他们将这种减少的浸润与对ICI的不良反应联系起来，即缺乏CD8⁺ T细胞的肿瘤对免疫治疗反应不佳。CD8⁺ T细胞也可诱导肿瘤细胞上的PD-L1表达，导致适应性耐药。然而，CD8⁺ T细胞浸润升高与较低复发率、较好结局相关，并且在淋巴上皮瘤样和爱泼斯坦-巴尔病毒相关的CCA中富集，是其有利的预后标志物。

理解这些先天性和适应性免疫群体如何在TME内相互作用，以及肿瘤衍生细胞因子如何调节它们，对于设计合理的免疫治疗策略仍然至关重要。CCA中观察到的深度免疫抑制既是对ICI疗效的障碍，也是多靶点干预的机会。

Immune phenotype of cholangiocarcinoma

Hegde等人提出了一个基于CD8⁺ T细胞在TME内空间分布的肿瘤免疫连续性，包含三种免疫表型，每种都与不同的免疫治疗反应相关。这些表型如下：（1）炎症型肿瘤；（2）免疫排斥型肿瘤；（3）免疫荒漠型肿瘤。炎症型肿瘤具有强大的CD8⁺ T细胞浸润、完整的抗原呈递、增加的干扰素-γ（IFN-γ）信号传导、高肿瘤突变负荷（TMB）和升高的PD-L1表达。也称为“热”肿瘤，它们通常对ICI更敏感。相比之下，免疫排斥型肿瘤具有扩增但浸润不良的CD8⁺ T细胞、低TMB、低PD-L1表达、增加的肿瘤血管生成，以及免疫抑制细胞如TAMs、MDSCs和Tregs的积累。免疫荒漠型肿瘤缺乏CD8⁺ T细胞，并且与免疫排斥型肿瘤一样，对PD-1/PD-L1阻断耐药。这些“冷”肿瘤的特征是免疫忽视，包括低主要组织相容性复合体I类呈递和差的肿瘤抗原呈递、Treg介导的耐受，以及不足的T细胞启动和活化，导致ICI耐药。

尽管许多研究将CCA视为一个统一的实体，但新出现的证据表明iCCA和eCCA亚型之间存在有意义的免疫学差异。使用批量基因表达谱分析，Job等人确定了iCCA的四种免疫亚型。近一半（46%）的肿瘤属于免疫荒漠组，其特征是免疫浸润极少且活化差。仅有13%表现出炎症表型，以高CD8⁺ T细胞浸润和活跃的免疫检查点信号为特征，与最长的中位生存期73个月相关，而免疫荒漠组为42个月。其余亚型包括一个髓系富集组（19%），具有中等免疫细胞存在但低淋巴样活性，以及一个间充质亚型（22%），具有高基质和ECM相关基因表达。后两种亚型的中位生存期较差（分别为25和19个月），可能代表免疫治疗耐药群体。

在另一项使用104份CCA样本（所有亚型）的多重免疫组织化学和基因表达谱分析的研究中，iCCA肿瘤具有更高密度的非耗竭CD8⁺ T细胞，这与改善的生存相关。相反，eCCA亚型显示较低的CD8⁺ T细胞浸润和PD-L1⁺ TAMs的富集，与较差的结局相关。Kitano等人也发现eCCA经常被TANs和Tregs浸润，这与CD8⁺ T细胞负相关，并与不良预后相关。

迄今为止，很少有研究直接比较iCCA和eCCA亚型的TME，大多数免疫学分析集中在iCCA上。这是一个关键空白，因为亚型特异的免疫谱可能显著影响免疫治疗反应性。未来的研究应优先进行对比性TME分析，以指导CCA的个体化治疗策略。

Mechanisms of immunotherapy resistance

CCA的多种疾病亚型、纤维化间质和免疫抑制性TME被认为是导致该癌症类型出现ICI耐药的原因。更好地理解TME内的组成和相互作用对于确定CCA患者最有效的免疫治疗策略至关重要。对免疫治疗的耐药涉及肿瘤内在和外在机制。肿瘤内在因素包括抗肿瘤免疫信号通路的改变，如IFN-γ通路，它上调肿瘤细胞上的PD-L1表达以帮助免疫逃逸。肿瘤细胞也可能分泌外泌体PD-L1到外周血，以系统性抑制T细胞功能，并表现出致癌突变（例如丝裂原活化蛋白激酶和表皮生长因子受体通路改变），这些都有助于免疫抑制。外在因素包括局部TME中存在免疫抑制细胞群（例如MDSCs、Tregs和TAMs），以及宿主相关因素，如年龄、性别、微生物组、遗传和环境。

在CCA TME中关键的免疫抑制群体是MDSCs和TAMs。MDSCs，髓系起源，可以是粒细胞/多形核（G-MDSCs或PMN-MDSCs）或单核细胞（M-MDSCs），分别类似于中性粒细胞和单核细胞。MDSCs通过促进免疫逃逸、血管生成、增殖、侵袭和转移来促进肿瘤进展。这些细胞通过产生细胞因子（例如TGF-β、IL-10）、活性氮氧化物、免疫活性酶（例如ARG、吲哚胺2,3-双加氧酶、氨肽酶）和前列腺素E2（PGE2）来抑制T细胞功能。在结肠炎和原发性硬化性胆管炎（PSC）的临床前小鼠模型中，肠道微生物组被证明可诱导肝细胞分泌CXCL1，从而招募趋化因子（C-X-C基序）受体（CXCR）2⁺ PMN-MDSCs并形成免疫抑制环境。PSC是一种胆管自身免疫性疾病，是CCA的重要风险因素；大约50%的CCA在PSC诊断后第一年内确诊。另一项研究发现，单独使用抗PD-L1疗法未能控制小鼠原位CCA；然而，耗竭PMN-MDSCs和TAMs增强了治疗反应，表明靶向PMN-MDSCs可能改善CCA中的ICI疗效。

TAMs通过释放促炎介质如IL-1β、IL-6和活性氮/氧中间体，促进慢性炎症致癌作用。它们通过过度表达PD-L1、ARG1、PGE2和TGF-β来抑制T细胞反应，并促进CCL22介导的Treg积累。Arlauckas等人证明，表达Fcγ受体的骨髓来源的TAMs可以从T细胞表面捕获抗PD-1抗体，导致PD-1抑制剂耐药。此外，在非小细胞肺癌（NSCLC）中，与PD-1、CTLA-4和淋巴细胞活化基因3共表达相关的T细胞功能障碍驱动疾病进展和ICI耐药。这些发现导致美国食品药品监督管理局（FDA）批准了ICI组合，包括帕博利珠单抗、纳武利尤单抗和伊匹木单抗，用于晚期NSCLC，突出了CCA的潜在可转化策略。

总的来说，TME内的免疫抑制细胞和分子是CCA中ICI疗效的主要障碍。靶向这些成分可能对于改善患者反应和克服治疗耐药性至关重要。

Manipulating the cholangiocarcinoma immune phenotype to improve response to immune checkpoint inhibitors

Targeting immunosuppressive cell populations

将“冷”TME转化为炎症性或“热”TME的努力已在各种癌症（包括CCA）中进行了探索，以提高免疫治疗反应性。鉴于其在CCA TME中的主导地位和重要性，靶向免疫抑制性TAMs和MDSCs代表了一种有前景的治疗方法。在CCA异种移植小鼠模型中，CSF1R抑制阻断了单核细胞向巨噬细胞的分化，降低了肿瘤细胞增殖并增加了凋亡，最终降低了肿瘤负荷。类似地，阻断单核细胞趋化蛋白1（MCP-1，一种TAMs的激活剂）在CCA异种移植模型中减少了TAM招募和肿瘤生长。GM-CSF，一种在髓系细胞编程中重要的细胞因子，与切除的iCCA患者OS降低相关。在一种原位小鼠CCA模型中，抑制GM-CSF减少了TAM丰度，将TAMs和MDSCs重极化以促进增加的T细胞反应，并减缓了肿瘤生长。

Tavazoie及其同事揭示，肝X核受体（LXR）的激动作用降低了小鼠模型和患者在一项首次人体剂量递增I期试验中的MDSC水平。LXR激活导致载脂蛋白E的转录上调，损害MDSC存活并增强CD8⁺ T细胞活化，覆盖了包括肺、黑色素瘤和结肠在内的几种癌症。这些结果支持LXR激动剂作为潜在药物，以增强如CCA等“冷”肿瘤中的ICI治疗。

在一个小鼠CCA模型中，Loeuillard等人发现，使用抗Ly6G抗体或LXR激动剂GW3965抑制MDSC，结合通过抗CSF1R抗体耗竭TAM，改善了抗PD-1疗效，延长了生存期并减少了肿瘤进展。重要的是，单独阻断TAM会导致G-MDSCs的代偿性出现，抵消其抗肿瘤效果，突出了同时抑制MDSCs和TAMs的重要性。另一项研究确定了一种限制抗CSF1R疗效的细胞交流机制，为之前的发现提供了解释。具体来说，肿瘤衍生的CSF1诱导组蛋白去乙酰化酶2介导的CAFs对粒细胞趋化因子表达的抑制，限制了粒细胞迁移。CSF1R抑制逆转了这种效应，导致PMN-MDSCs的积累。

双重靶向免疫抑制性TAMs和MDSCs可能克服代偿性免疫抑制机制并增强CCA中的ICI反应。该策略值得在临床试验中进一步研究。

Modulating cytokine signalling

另一个合理的靶点是细胞因子TGF-β，已发现其促进CCA的发生和进展。Huang等人揭示，抑制TGF-β1可抑制CCA生长，而其过表达则产生相反效果，甚至在大鼠模型中诱导肝内转移。一项体外研究进一步表明，靶向DCs上的IL-10和TGF-β的细胞因子受体增强了DC激活的CD8⁺ T细胞对CCA细胞系的细胞溶解活性，支持该策略作为增强“冷”肿瘤中ICI疗效的一种手段。Lustri及其同事在原发性人类黏液性和混合性肝内CCA细胞培养物中评估了两种TGF-β1抑制剂，发现一种降低了细胞活力并诱导凋亡，而另一种损害了细胞迁移。通过两种抑制剂的组合，靶向TGF-β信号传导的两个不同轴，被提议以更有效地破坏肿瘤存活并诱导人类CCA细胞凋亡。

然而，TGF-β靶向疗法的临床转化迄今有限。一项在30名晚期HCC患者中进行的bintrafusp alfa（一种同时靶向TGF-β和PD-L1的双功能融合蛋白）的I期开放标签试验显示了可管理的安全性和初步疗效。一项包含159名CCA患者的扩展II期试验在未能达到改善OS的主要终点后终止，尽管在9个月随访中报告ORR为10.1%。尽管如此，新型TGF-β1抑制剂与ICI联合使用仍然是未来临床试验中有前景的领域，可能增强CCA对免疫治疗的反应。

细胞因子输注疗法是另一种正在研究中的用于CCA的新兴免疫治疗方法，涉及给予内源性或工程化细胞因子以直接调节TME。一项II期试验证明了将细胞因子输注与ICI联合使用的潜在协同效应。与帕博利珠单抗单药治疗相比，添加静脉注射GM-CSF改善了疗效，这是由于抗原呈递增加和DC招募。尽管疗效增强，该试验未达到其ORR终点，并且69%的患者发生了不良事件。

Immune activation approaches

使用CD40激动剂刺激巨噬细胞和DCs来激活和启动CD8⁺ T细胞是另一种提高ICI反应的合理方法。在小鼠iCCA模型中，抗CD40和抗PD-1抗体的联合治疗与任一单药治疗相比显著降低了肿瘤负荷。这伴随着巨噬细胞、DCs和效应免疫细胞（包括CD8⁺/CD4⁺ T细胞和NK细胞）浸润的增加。CD40激动作用与ICI联合可能为CCA提供有效的治疗途径。有趣的是，双重CD40/PD-1阻断显著改善了对吉西他滨-顺铂的反应，与单独化疗相比延长了OS。

干扰素基因刺激物（STING）通路的激活是通过促进淋巴细胞浸润和TAM重极化将“冷”肿瘤转化为“热”肿瘤的另一种方式。一项研究调查了STING表达及其在iCCA中的作用。对44名患者的FFPE组织进行的免疫组织化学分析显示，