一种兼具抗癌活性的双功能比色探针的集成实验与计算研究：来自密度泛函理论（DFT）、分子对接及分子动力学模拟的见解

《Materials Advances》：Integrated experimental and computational investigation of a dual-functional colorimetric probe with anticancer activity for selective arginine sensing: insights from DFT, molecular docking, and molecular dynamics simulations

本工作合成了新型anthracene基Schiff碱探针P1，其通过UV-Vis光谱和NMR验证了对精氨酸的特异性检测（检测限1.24 nM），并利用DFT、分子对接和动力学模拟揭示了分子机制及与Mcl-1蛋白的相互作用。实验表明P1具有抗癌活性（IC50=20 μM）和良好的生物相容性，为双功能探针开发提供新思路。

　　一种基于蒽醌的新型席夫碱探针（P1）通过简单的缩合反应合成，其对精氨酸的检测表现出显著的灵敏度和选择性。这种探针能够实现颜色变化的检测，检测限低至1.24 nM，这使其在生物医学领域具有潜在的广泛应用价值。通过紫外-可见光谱、氢谱核磁共振（NMR）滴定实验以及密度泛函理论（DFT）研究，明确了P1与精氨酸的结合模型和作用机制。研究发现，P1的光学响应来源于分子内的电荷转移机制，这一结论通过前线分子轨道（FMO）分析得到了验证。此外，P1在商业膳食补充剂中成功检测到精氨酸，进一步验证了其在实际应用中的可行性。除了作为检测探针的功能外，P1还展现出显著的抗癌活性，其在MCF7和HeLa细胞中的半数抑制浓度（IC50）为20 μM，表明其在抗癌治疗中具有潜力。通过Annexin V-PI结合实验，P1对癌细胞的凋亡效应呈现出剂量依赖性，进一步支持了其抗癌机制。分子对接研究还揭示了P1与抗凋亡蛋白Myeloid Cell Leukemia 1（Mcl-1）具有显著的结合亲和力，这一稳定性得到了分子动力学模拟（MD）研究的支持。此外，溶血实验结果显示P1具有良好的生物相容性，为它在治疗应用中的安全性和可行性提供了证据。这些发现表明，P1可能成为一种兼具诊断和治疗功能的双效分子，在生物医学领域具有广阔的应用前景。

精氨酸是生命活动中不可或缺的氨基酸之一，它在免疫保护、营养运输、蛋白质合成等方面发挥着重要作用。精氨酸的高等电点（pI = 10.76）和强碱性（pKa ～12.5）使其在生理条件下保持正电荷，能够与负电荷的生物分子和酶发生强烈的静电相互作用，从而稳定反应中间体。它还参与肠道干细胞迁移、蛋白质再生、细胞分裂等关键生物过程。精氨酸水平的异常常与多种疾病相关，如癌症，其中它通过代谢重编程和免疫调节促进肿瘤的生长和进展。因此，对精氨酸的高选择性和高灵敏度检测在诊断和治疗中具有重要意义。目前，精氨酸的检测方法主要包括荧光光谱、电泳和高效液相色谱（HPLC）等，但这些方法往往需要实验室设备，难以满足实时检测的需求。因此，开发一种快速、高选择性且易操作的检测探针成为研究的热点。

在这一背景下，P1作为一种新型的显色化学传感器，具备出色的性能。它不仅能够快速响应精氨酸的存在，还能够通过肉眼观察到颜色变化，从而实现了快速、直观的检测。P1的合成过程简单，通过蒽醌-9-醛与水合肼的缩合反应即可完成。该反应在甲醇中进行，并在60°C下回流。通过薄层色谱（TLC）监控反应进程，最终通过重结晶得到红色固体产物，产率高达92%。合成后的P1在结构和功能上得到了详细的表征，包括氢谱核磁共振（NMR）和红外光谱（FTIR），这些实验不仅验证了P1的结构，还揭示了其与精氨酸的相互作用特征。

紫外-可见光谱实验进一步揭示了P1在检测精氨酸时的响应机制。当P1与精氨酸结合时，其在440 nm处的吸收峰强度减弱并发生红移，同时在540 nm处出现新的吸收峰，这一变化表明了稳定的结合复合物的形成。而与其他氨基酸的结合则未引起显著的光谱变化，进一步证实了P1对精氨酸的高度选择性。为了验证其在复杂生物环境中的适用性，研究人员还对P1在不同盐浓度和生物介质中的稳定性进行了评估。结果表明，即使在高盐浓度（100 mM）和存在血清蛋白（如牛血清白蛋白BSA）的情况下，P1仍能保持良好的响应特性，这为它在实际生物样品中的应用提供了理论依据。

时间依赖性研究进一步证明了P1对精氨酸的快速响应能力。在加入等量的精氨酸后，P1的吸收光谱在540 nm处迅速变化，并保持一致，说明其具有快速、可靠的检测性能。通过竞争结合实验，研究人员还验证了P1在存在其他氨基酸的情况下对精氨酸的特异性。尽管某些氨基酸如天冬氨酸在一定程度上可能引起轻微干扰，但P1在与精氨酸结合时仍能表现出显著的光谱变化，这表明其在实际应用中具有高度的选择性。此外，P1在实际膳食补充剂样品中的检测实验也验证了其在复杂基质中的实用性，其颜色变化和吸收光谱的变化均与精氨酸的存在密切相关。

为了深入理解P1与精氨酸的结合机制，研究人员还进行了密度泛函理论（DFT）计算。DFT计算不仅揭示了P1的分子结构和电子分布特性，还进一步阐明了其与精氨酸之间的相互作用模式。通过分析分子轨道（FMO）和电子结构，研究人员发现P1的光谱响应主要源于分子内的电荷转移机制。这种机制在结合精氨酸后得到了增强，表现为吸收峰的红移和强度变化。此外，自然键轨道（NBO）分析显示，P1在与精氨酸结合后，氮原子的电荷分布发生了显著变化，进一步支持了电荷转移过程的发生。非共价相互作用（NCI）和减少密度梯度（RDG）分析则揭示了P1与精氨酸之间的氢键和静电相互作用，表明其结合过程涉及分子内和分子间的复杂相互作用。

分子对接研究进一步揭示了P1在抗癌治疗中的潜力。通过使用Way2Drug提供的在线资源，研究人员预测了P1可能的靶点，并选择了Mcl-1蛋白作为研究对象。Mcl-1是一种抗凋亡蛋白，其在肿瘤发生和治疗抵抗中起着关键作用，因此成为抗癌治疗的重要靶点。分子对接结果显示，P1与Mcl-1蛋白的结合亲和力较高，其结合能为-15.48 kcal mol?1，高于已知的Mcl-1抑制剂如5WL（-12.63 kcal mol?1）。这表明P1可能通过与Mcl-1的结合，干扰其正常功能，从而抑制癌细胞的生长和存活。此外，P1与Mcl-1的结合还表现为氢键和π-π相互作用，这与已知的Mcl-1抑制剂的结合模式一致，进一步支持了其作为抗癌药物的潜力。

为了验证P1的抗癌活性，研究人员还进行了细胞活力（MTT）和凋亡（Annexin V-PI）实验。在MCF7和HeLa细胞中，P1表现出剂量依赖性的细胞毒性，其IC50值为20 μM，表明其在低浓度下具有一定的抗癌作用。然而，与顺铂（cisplatin）相比，P1的抗癌活性较低，这可能意味着其在实际应用中需要进一步优化。通过Annexin V-PI实验，研究人员观察到P1能够显著增加MCF7细胞的凋亡比例，表明其通过诱导细胞凋亡发挥抗癌作用。同时，溶血实验显示P1在20 μM浓度下对红细胞几乎没有毒性，进一步验证了其在生物体内使用的安全性。

为了评估P1在生物环境中的稳定性，研究人员还进行了分子动力学模拟（MD）。通过在300 ns的时间尺度上模拟P1与Mcl-1的结合复合物，研究人员评估了其在不同条件下的结构稳定性和相互作用能。结果表明，P1在与Mcl-1结合后，其结构表现出较高的稳定性，主要体现在根均方偏差（RMSD）、根均方波动（RMSF）和回转半径（RoG）等参数上。此外，氢键相互作用分析显示，P1在与Mcl-1结合后，能够形成更多的氢键，进一步增强了其结合的稳定性。结合能分析则表明，P1在与Mcl-1的结合过程中，表现出较强的非键相互作用，如库仑相互作用和范德华相互作用，这些相互作用共同作用，确保了P1在生物环境中的有效性和稳定性。

综合来看，P1不仅在精氨酸的检测方面表现出色，还在抗癌治疗中展现出一定的潜力。其结构设计结合了显色响应单元和促进生物相互作用的特性，使其在诊断和治疗方面具有双重功能。通过实验和计算方法的结合，研究人员不仅揭示了P1的检测机制，还进一步探讨了其作为抗癌药物的可能性。P1的高选择性、低检测限以及良好的生物相容性，使其成为一种具有广泛应用前景的分子探针。未来的研究可以进一步优化其结构，提高其抗癌活性，并探索其在临床诊断和治疗中的具体应用。