浓缩生长因子通过增加特定肿瘤细胞系中的神经酰胺生成，诱发内质网应激和细胞凋亡

《Journal of Cellular and Molecular Medicine》：Concentrated Growth Factor Induces ER Stress and Apoptosis by Increasing Ceramide Generation in Selected Tumour Cell Lines

CGF-CM通过线粒体功能障碍、内质网应激、自噬抑制及脂代谢紊乱选择性诱导乳腺癌（MCF7）和骨肉瘤（SaOS-2）细胞凋亡，但对MDA-231和MG-63无显著毒性，其作用机制与BAX/BCL-2比值升高、ceramide积累及LC3/p62蛋白变化相关。

　　CGF（浓缩生长因子）作为一种源自血液的自体生物材料，在再生医学领域中的应用日益广泛。近年来，它也开始被用于与癌症相关的手术中。CGF富含细胞因子、血小板、有核细胞以及纤维蛋白支架，这些成分赋予其治疗潜力，但同时也需要在肿瘤学中进行严格的安全评估。本研究旨在探讨CGF培养基（CGF-CM）对乳腺癌细胞（MCF7和MDA-231）及骨肉瘤细胞（SaOS-2和MG-63）的影响。研究结果表明，CGF-CM在MCF7和SaOS-2细胞中具有选择性的细胞毒性作用，而在MDA-231和MG-63细胞中未观察到明显的细胞毒性。进一步的分析发现，MCF7和SaOS-2细胞中早期凋亡伴随线粒体功能障碍，表现为BAX/BCL-2比值升高和细胞色素c的释放。此外，CGF-CM处理还导致了鞘氨醇（ceramide）和甘油三酯（triglycerides）水平的上升，揭示了脂质代谢变化与肿瘤细胞死亡之间的潜在联系。内质网（ER）应激标志物ATF6和XBP1在MCF7和SaOS-2细胞中显著上调，突显了ER应激在CGF-CM诱导细胞毒性中的作用。同时，CGF-CM抑制了自噬流，如通过LC3和p62蛋白水平的变化所观察到的，这破坏了细胞的稳态，进一步促进了凋亡。这些发现表明CGF-CM对特定的肿瘤细胞具有选择性的细胞毒性作用。线粒体功能障碍、ER应激、自噬抑制以及脂质代谢变化之间的复杂相互作用，也揭示了CGF-CM作用机制的复杂性。

在引入CGF之前，人们已经探索了血小板衍生产品（如PRP和PRF）在促进伤口愈合和减少手术副作用方面的应用。研究发现，PRP在损伤部位的应用有助于降低并发症发生率，同时不增加局部复发率。PRP与OncoTherad（MRB-CFI-1）的结合在非肌肉浸润性膀胱癌（NMIBC）的治疗中显示出一定的潜力，能够增强免疫激活，抑制肿瘤进展，并调控NMIBC的微环境，使其具有细胞毒性特征。PRF同样在骨成骨细胞和成纤维细胞中显示出减少肿瘤细胞增殖和促进肿瘤抑制基因表达的能力，表明其在治疗局部肿瘤方面具有潜在的治疗价值。然而，值得注意的是，PRF在某些癌症类型中（如口腔鳞状细胞癌）反而会刺激细胞增殖和迁移，引发了对其在特定肿瘤类型中的使用安全性方面的担忧。

PRF和CGF在癌症治疗中的应用存在复杂的分子机制，这些机制受到肿瘤类型、微环境以及血小板衍生产品中生长因子和细胞因子平衡的影响。尽管已有研究探讨了PRF在癌症患者中的应用，但对其在肿瘤细胞上的分子作用机制仍然了解有限。我们的前期研究显示，CGF作为第三代血小板衍生产品，其结构被修改为PRF的一种形式，能够促进骨再生相关的细胞招募、增殖和成熟。CGF的纤维蛋白支架中，生长因子和细胞的浓度高于其他自体血小板浓缩物。这些生长因子包括血小板源性生长因子、转化生长因子-β1、成纤维细胞生长因子β、血管内皮生长因子（VEGF）、胰岛素样生长因子、内皮生长因子和骨形态发生蛋白。这些生长因子逐渐释放，确保了再生特性的可控性和持续性，同时降低了由于生长因子浓度过高而引起的炎症反应的风险。CGF还能激活巨噬细胞，促进THP-1单核/巨噬细胞的转化，从而创造有利于组织再生的微环境。在损伤部位释放的抗炎细胞因子和生长因子激活了细胞内的信号通路，如PI3K/AKT和MAPK/ERK通路，这些通路促进了细胞存活、血管生成和再生。

本研究聚焦于CGF-CM对乳腺癌细胞（MCF7和MDA-231）和骨肉瘤细胞（SaOS-2和MG-63）的影响。研究发现，CGF-CM在4天的处理后，对MCF7和SaOS-2细胞的细胞毒性作用显著，而在MDA-231和MG-63细胞中则未观察到类似的效应。进一步的分析表明，CGF-CM在MCF7和SaOS-2细胞中诱导了早期凋亡，这一结果通过流式细胞术检测的凋亡和坏死细胞群体以及通过荧光显微镜观察的DNA损伤得到了支持。值得注意的是，CGF的细胞毒性作用表现出一定的特异性，仅对MCF7和SaOS-2细胞有效，而对MDA-231和MG-63细胞则无明显影响。此外，CGF-CM对MG-63和MDA-231细胞的增殖和迁移没有产生影响。在MDA-231细胞中，CGF-CM处理导致脂质代谢相关酶的表达增加，尽管未观察到总脂质水平的显著变化。在MDA-231和MG-63细胞中，没有观察到DNA损伤或细胞侵袭能力的增加，这表明CGF在这些细胞中的作用可能不涉及细胞毒性。

DNA损伤在凋亡过程中积累，尤其是在PARP失活之后。PARP是一种DNA修复酶，其失活会导致细胞内能量消耗过多。Caspase-3和Caspase-7则负责PARP的切割，从而防止能量耗竭和坏死，同时促进凋亡。MCF7细胞不表达Caspase-3，因此我们分析了Caspase-7的水平。CGF处理在MCF7和SaOS-2细胞中诱导了Caspase-7的激活。然而，PARP的切割仅在MCF7细胞中被观察到，而SaOS-2细胞则表现出总PARP蛋白水平的增加，但未检测到其切割产物。这一发现与最近的研究结果一致，表明在缺乏PARP切割的情况下，骨肉瘤细胞仍可能经历凋亡。近年来，PARP抑制剂已被测试为治疗骨肉瘤的有效手段，因为PARP蛋白的高水平与较差的预后相关。细胞存活数据表明，SaOS-2细胞可能比MCF7细胞对CGF-CM处理更具抗性，因为MCF7细胞在4天的处理后出现死亡，而SaOS-2细胞则在7天后才表现出类似现象。

CGF-CM处理在MCF7和SaOS-2细胞中显著提高了BAX/BCL-2比值，并促进了细胞色素c从线粒体释放到细胞质中的过程，这支持了内在凋亡通路的参与。BAX是一种抗凋亡蛋白，与其他BCL2家族蛋白一起参与线粒体通透性变化，导致线粒体膜电位的下降。线粒体膜电位的下降可能由线粒体膜上的孔道开启所引起。因此，CGF处理可能通过干扰线粒体功能，进而引发细胞凋亡。

CGF-CM处理在MCF7和SaOS-2细胞中诱导了内质网应激，同时抑制了自噬流。这些效应通过检测ATF6和XBP1蛋白水平的显著上调以及LC3和p62蛋白水平的变化得到了验证。内质网应激和自噬流的改变可能共同作用，促进细胞凋亡。此外，LC3蛋白在细胞核中的积累也表明CGF处理可能通过诱导细胞应激，影响自噬过程。自噬在维持细胞稳态和清除受损线粒体方面发挥着重要作用，因此CGF-CM对自噬的抑制可能进一步加剧线粒体功能障碍，从而导致细胞凋亡。

综上所述，我们的研究结果表明CGF在特定的肿瘤细胞（如MCF7和SaOS-2）中具有选择性的细胞毒性作用。CGF通过激活内质网应激通路，增加脂质合成相关基因的表达，进而导致鞘氨醇水平的上升。这些变化抑制了自噬并干扰了线粒体功能，激活了内在凋亡通路。尽管本研究揭示了CGF-CM的作用机制，但仍需进一步研究以阐明这些效应的分子基础，并评估CGF在癌症治疗中的潜在应用价值。此外，还需要更多的研究来确认CGF在其他肿瘤类型中的安全性，如在MDA-231和MG-63细胞中未观察到细胞毒性效应，这表明CGF在这些细胞中的作用可能不涉及细胞死亡。