综述：甲酸盐向有机化合物的生物转化：迈向可持续的甲酸盐生物经济

《Carbon Energy》：Biological Conversion of Formate to Organic Compounds: Toward a Sustainable Formate Bioeconomy

本文系统综述了甲酸盐生物转化的最新进展，重点探讨了能够利用甲酸盐的微生物宿主、甲酸盐同化途径以及提高甲酸盐利用效率的微生物工程策略。文章指出，通过优化天然甲酸盐同化途径（如丝氨酸循环、还原性乙酰辅A途径等）、构建合成途径以及设计人工途径，并结合关键酶工程、宿主适应进化等策略，有望实现甲酸盐高效转化为生物燃料和高附加值化学品，推动可持续生物制造发展。

　　

微生物宿主用于甲酸盐利用

多种微生物宿主能够利用甲酸盐，包括天然甲基营养微生物（如产乙酸菌、产甲烷菌、甲基杆菌等）和通过代谢工程改造的非天然甲基营养微生物（如大肠杆菌、酿酒酵母等）。宿主的选择和改造需综合考虑代谢途径、细胞生长速率、环境耐受性、产物类型和遗传工具等因素。

天然甲基营养菌

甲酸盐作为一种有机一碳化合物，可被甲基营养微生物利用。目前已知的天然甲基营养微生物有58种，主要存在于土壤和水中，例如产乙酸菌、产甲烷菌和甲基杆菌。这些微生物能够通过多种代谢途径将甲酸盐转化为高附加值化学品，如乙酸、丁酸和生物塑料。

产乙酸菌

产乙酸菌是一类厌氧微生物，主要分布在人类和动物胃肠道、土壤和沉积物中。它们能够利用多种底物生长并合成代谢产物，如乙酸、丁酸、乙醇和乳酸。根据底物不同，产乙酸菌可分为两类：一类利用无机碳源（如CO₂、CO）自养生长；另一类利用有机碳源（如葡萄糖、蔗糖等）异养生长。甲酸盐既可作为甲基供体（提供碳原子），也可作为电子供体（提供还原力）。然而，其利用效率受底物浓度限制，低浓度时不足以满足细胞碳和能量需求，高浓度时则对细胞有毒害作用。目前只有少数产乙酸菌能在甲酸盐上生长，例如Clostridium bovifaecis、Acetobacterium woodii、Cupriavidus necator等。以A. woodii为例，利用H₂/CO₂生产乙酸的能量效率为74%，而以甲酸盐和甲醇为混合碳源时能量效率可达89%。通量平衡分析显示，A. woodii在利用甲酸盐生产乙醇和乳酸时，能量效率可达70%-92%。

产甲烷菌

产甲烷菌是一类严格厌氧的古菌，存在于缺氧土壤、沉积物、海床和沼泽中。它们能够利用甲酸盐、乙酸、氢气和CO₂等基本物质合成甲烷。根据底物利用方式，产甲烷菌可分为三类：利用乙酸合成甲烷的乙酸营养型产甲烷菌；利用H₂/CO₂或甲酸盐合成甲烷的氢营养型产甲烷菌；利用含甲基小分子合成甲烷的甲基营养型产甲烷菌。其中，氢营养型和甲基营养型产甲烷菌是甲酸盐利用的主要微生物，氢营养型产甲烷菌的效率最高。Methanococcus maripaludis是常见的氢营养型产甲烷菌，但其代谢网络复杂，细胞生长速率较慢，限制了生物合成能力。通过构建其基因组尺度代谢网络模型（iMM518）可以预测代谢通量，为后续代谢工程改造奠定基础。

甲基杆菌

甲基杆菌是好氧微生物，但在缺氧环境中表现出兼性厌氧特性，广泛存在于土壤、灰尘、淡水和湖泊沉积物等自然栖息地。它们具有固氮、增磷、耐受非生物胁迫、促进植物生长和生物防治等特性，在农业和环境保护领域有应用前景。甲基杆菌可分为两类：一类能在甲烷、甲醇、甲醛、甲酸盐和甲胺等一碳化合物上生长；另一类能在甘油、丙二酸、琥珀酸、富马酸、α-酮戊二酸、乳酸和丙酮酸等多碳化合物上生长。在大多数甲基杆菌中，来自底物的甲醛被引导至不同的代谢途径，一部分被氧化成CO₂产生能量，另一部分通过丝氨酸循环和核酮单磷酸循环同化为细胞内代谢物。Methylobacterium extorquens是甲基杆菌的模式菌株，能够通过四氢叶酸途径同化甲酸盐。其常见菌株包括AM1、PA1、CM4和DM4，其中AM1研究最为广泛。通过将甲酸盐与甲醇基生产耦合，甲羟戊酸产量提高了64.57%。全基因组分析显示，M. extorquens AM1拥有三种不同的甲酸脱氢酶（FDH），虽然这些FDH对甲醇上的细胞生长并非必不可少，但至少需要一种FDH才能在甲酸盐上生长。

其他

除上述微生物外，一些其他微生物也具有同化甲酸盐的能力，例如硫酸盐还原菌。这些严格厌氧菌在碳和硫循环中扮演重要角色，主要存在于金矿和铜锌矿的尾矿以及乳制品和冶金厂的废水中。目前只有少数硫酸盐还原菌能够利用甲酸盐作为碳源或电子供体，例如Desulfovibrio aminophilus、Desulfovibrio paquesii等。此外，Paracoccus communis MA5能够同化甲酸盐合成单细胞蛋白；Cupriavidus necator H16能够利用甲酸盐作为唯一碳源和能源生产生物塑料聚合物；Sinorhizobium meliloti具有甲酸盐依赖性自养生长的显著能力。

非天然甲基营养菌

尽管许多天然甲基营养微生物能够利用甲酸盐并将其转化为各种代谢产物，但在甲酸盐利用过程中仍存在一些挑战，例如甲酸盐同化能力不足、遗传修饰困难、生物量产量低和代谢产物有限。为了解决这些问题，可以将甲酸盐同化途径异源导入易于遗传修饰的模式微生物中，从而促进甲酸盐的高效利用。这些工业宿主微生物主要包括大肠杆菌、酿酒酵母、恶臭假单胞菌和谷氨酸棒杆菌。

大肠杆菌

作为最常见的模式微生物，大肠杆菌具有生长快、营养要求简单、易于遗传修饰等特点，是遗传修饰宿主的首选。通过将丝氨酸循环等相关途径引入大肠杆菌，可以开发出能够利用甲酸盐作为碳源的突变菌株。例如，将来自M. extorquens AM1的丝氨酸循环相关基因（ftfL、fch、mtdA）引入大肠杆菌，使其能够有效利用甲酸盐。此外，通过实验室适应性进化（ALE）分离出经过150次连续传代后能在甲酸盐上快速生长的大肠杆菌突变株。同样，通过将还原甘氨酸（rGly）途径引入大肠杆菌，整合来自M. extorquens AM1的三种酶并过表达甘氨酸裂解系统（GCS）中的四种蛋白，成功实现了甲酸盐的同化和利用。

酿酒酵母

酿酒酵母是微生物发酵最典型的代表，也是最广泛使用和最成熟的细胞工厂之一。作为微生物底盘，它在生物转化过程中显示出巨大潜力，在医学、化学工业、食品生产等领域有重要应用。酿酒酵母利用甲酸盐有几个显著优势：能够通过代谢甲酸盐产生能量；含有内源性FDH和rGly途径相关酶；对甲酸盐有良好的耐受性；代谢产物产量受甲酸盐影响。例如，通过将NADH依赖性FDH与还原戊糖磷酸（CBB）循环整合，甲酸盐利用率提高了21.8倍，游离脂肪酸产量提高了33.7倍。

恶臭假单胞菌

恶臭假单胞菌具有显著的适应性，能够在胁迫条件下有效利用多种碳源。此外，它拥有天然的NAD⁺依赖性FDH，是一种有前景的非天然宿主微生物。例如，恶臭假单胞菌KT2440含有至少两种FDH，将甲酸盐作为辅助能源可以显著提高NADH的再生速率。甲酸盐还能刺激恶臭假单胞菌9816在甲醇上生长，加速甲醇利用。

其他

除上述微生物外，谷氨酸棒杆菌和毕赤酵母等也是有前景的一碳资源利用底盘菌株。例如，将来自Clostridium ljungdahlii的甲酸盐-THF循环引入谷氨酸棒杆菌，并过表达反向GCS，构建了能够通过rGly途径同化甲酸盐的菌株。通过模块化工程和ALE优化，工程菌株在葡萄糖和甲酸盐共发酵时，琥珀酸产量达到1.3 g/L。在Komagataella phaffii中，甲酸盐可作为AOX1启动子的有效诱导剂，通过共表达乙酰辅酶A合酶、乙醛脱氢酶和转录因子Mit1，构建了甲酸盐同化途径，使木聚糖酶产量提高了103.5%。

甲酸盐利用的微生物途径

天然甲基营养微生物拥有多种甲酸盐同化途径，包括丝氨酸循环、还原性乙酰辅酶A途径、rGly途径和CBB循环等。然而，这些天然途径存在代谢机制复杂、代谢效率有限和碳损失严重等缺点。因此，对天然甲酸盐代谢途径进行改造，以及计算机辅助人工设计同化途径受到了广泛关注。

天然甲酸盐利用途径

丝氨酸循环

丝氨酸循环是一种天然甲酸盐同化途径，对氧气不敏感。一些甲基营养菌，如M. extorquens，能够利用该途径从甲酸盐合成乙酰辅酶A，且无碳损失。首先，甲酸盐通过甲酸盐四氢叶酸连接酶、亚甲基四氢叶酸环化水解酶和亚甲基四氢叶酸脱氢酶的酶催化转化为甲基四氢叶酸，进入丝氨酸代谢途径。整个循环消耗七分子甲酸盐，其中一分子用于固定CO₂产生一分子乙酰辅酶A，六分子用于产生三分子NAD(P)H和三分子ATP。丝氨酸循环中的酶具有耐氧性，且合成的丝氨酸易于整合到中心碳代谢中。然而，使用该途径的天然微生物存在能量和还原力消耗高、微生物细胞生长缓慢及相关代谢产物有限等问题。

还原性乙酰辅酶A途径

还原性乙酰辅酶A途径，也称为Wood–Ljungdahl途径，最初在厌氧微生物如产乙酸菌和产甲烷菌中发现。该途径是能量生产和CO₂固定的关键机制，在碳循环中起着不可或缺的作用。在此途径中，一分子CO₂与四氢叶酸结合并还原形成甲基，另一分子CO₂经一氧化碳脱氢酶催化形成羰基，甲基和羰基在乙酰辅酶A合酶的催化下产生乙酰辅酶A。通常，整个途径需要四分子甲酸盐。该途径特点是反应数量少、能耗低。但目前使用该途径的微生物所能合成的化学品范围有限，且代谢工程修饰困难，对氧气敏感。

还原甘氨酸途径

rGly途径最初是为合成同化CO₂/甲酸盐而设计的工程途径，后来发现其在一些产乙酸菌和硫酸盐还原菌中存在天然类似物。它是细胞在甲酸盐和CO₂上生长最有效的需氧途径，便于从甲酸盐和CO₂生产广泛的生物基产品。rGly途径可分为三个模块，有两种形成丙酮酸的途径。与Wood–Ljungdahl途径相比，rGly途径中的酶普遍存在于各种生物体中，且大多对氧气不敏感，与中心碳代谢途径重叠最小，便于异源引入和代谢工程改造以生产多种化学品。

CBB循环

CBB循环，也称为Calvin-Benson-Bassham循环，是公认的利用甲酸盐进行微生物自养生长的天然碳同化途径，最初在C. necator中发现。CBB循环将甲酸盐氧化成CO₂，产生碳固定和细胞生长所需的还原力和能量。每个CBB循环需要固定三分子CO₂，消耗四分子NAD(P)H和七分子ATP。然而，微生物利用该途径在甲酸盐上生长的能量效率有限，仅为20%-35%。这主要是由于CBB循环中电子转移需要消耗大量能量，以及NAD⁺的生理还原电位显著高于CO₂向甲酸盐或甲醇转化的还原电位，使得电子转移在热力学上不利。

甘氨酸丝氨酸和苏氨酸丝氨酸途径

最近，在Yarrowia lipolytica W29中发现了一种新的天然甲酸盐同化途径——甘氨酸丝氨酸和苏氨酸丝氨酸途径（gSer-tSer bicycle）。在该循环中，甲酸盐可作为微生物生长和代谢产物合成的碳源和能源。这种双循环途径在增强甘氨酸供应和促进甲酸盐同化方面起着关键作用。gSer-tSer bicycle由gSer循环和tSer循环组成，是一个以乙醛酸和苏氨酸为中心的自催化双循环途径。与rGly途径相比，gSer-tSer bicycle规避了GCS的反向作用，从而缓解了代谢挑战并提高了代谢效率。

合成甲酸盐利用途径

为了提高甲酸盐利用效率和化学品产量，研究人员开发了许多方法来重构天然甲酸盐利用途径，包括重构的卡尔文循环、丝氨酸-TCA循环、丝氨酸-苏氨酸途径和糖异生-非氧化糖酵解循环等。

重构的卡尔文循环

重构的卡尔文循环主要发生在大肠杆菌等模式微生物中，可以将异养微生物转变为自养模式。与原始卡尔文循环不同，该途径通过敲除中心碳代谢中的两个酶（糖酵解中的磷酸果糖激酶和磷酸戊糖途径中的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶）并异源表达四种酶（Rubisco、磷酸核酮糖激酶、碳酸酐酶和FDH）来实现。通过在大肠杆菌中重构卡尔文循环，迫使细菌使用CO₂作为唯一碳源，甲酸盐作为能源。

丝氨酸-TCA循环和丝氨酸-苏氨酸途径

丝氨酸-TCA循环和丝氨酸-苏氨酸循环代表了修饰的丝氨酸循环。丝氨酸-TCA循环最初在Vibrio natriegens中发现，由于其对甲酸盐的显著耐受性和代谢能力，已被开发为甲酸盐利用和转化的平台微生物。丝氨酸-苏氨酸循环是丝氨酸的一种天然变体途径，主要存在于大肠杆菌和酿酒酵母等模式微生物中。在丝氨酸-TCA循环中，通过破坏两组基因来改善甲酸盐的利用。丝氨酸-苏氨酸循环则通过一系列反应完成整个循环，避免了有毒中间体羟基丙酮酸的生成。

GNG-NOG循环

为了减少甲酸盐利用中的碳损失，提出了GNG-NOG循环，该循环代表了糖异生途径与非氧化糖酵解途径的增强整合。在该循环中，甲酸盐经丙酮酸甲酸裂解酶催化转化为丙酮酸，然后丙酮酸进入糖异生途径合成己糖磷酸，继而进入非氧化糖酵解循环，中间体木酮糖-5-磷酸经磷酸酮醇酶催化转化为甘油醛-3-磷酸和乙酰磷酸。整个循环不产生CO₂，由ATP驱动。

重构的THF循环和反向甘氨酸裂解途径

虽然已经开发了许多甲酸盐同化途径，但rTHF-rgcv途径被认为是同化甲酸盐和CO₂的最有利选择之一。该途径相对简单，所需的酶促步骤少，并且允许直接同化，而无需将甲酸盐转化为有毒的中间体甲醛。rTHF-rgcv途径有效解决了THF循环中甲酸盐同化效率低的问题。将rTHF-rgcv途径用于改造大肠杆菌以实现甲酸盐同化，主要分为两个模块。整个途径从两分子甲酸盐和一分子CO₂合成一分子丙酮酸，消耗三分子NAD(P)H和两分子ATP。

人工甲酸盐利用途径

为了解决天然和合成甲酸盐利用途径中的能量效率低、碳损失和反应步骤冗余等问题，采用计算机辅助人工设计开发新型甲酸盐利用途径的创新方法已成为突出趋势，包括甲酸裂合酶途径和合成乙酰辅酶A途径。

FLS途径

FLS是为了将一碳化合物转化为三碳化合物而开发的，它促进三个甲醛分子偶联产生三碳化合物。因此，FLS途径有望通过甲酸盐捕获一碳单元，满足可持续原料的需求。该途径的关键酶是基于苯甲醛裂解酶，通过蛋白质工程和计算机辅助设计进行设计和优化。FLS途径分为四个关键阶段，仅需四步即可将甲酸盐转化为中心代谢物DHAP。与天然途径相比，FLS途径是线性的、对氧气不敏感、热力学有利且碳利用率高。

SACA途径

为了减少与已建立代谢网络的重叠并合理分配代谢通量，结合蛋白质工程从头设计了SACA途径。该人工途径在催化效率、生物质产量和驱动力方面具有明显优势。在此途径中，甲酸盐首先被FDH氧化成CO₂，产生NADH；随后CO₂通过电化学或酶电极系统还原为甲醛；两分子甲醛经乙醛合酶缩合形成乙醛；乙醛经乙酰磷酸合酶转化为乙酰磷酸；最后通过磷酸乙酰转移酶生成乙酰辅酶A。完整的SACA途径不消耗NAD(P)H和ATP，总吉布斯能量变化为-96.7 kJ/mol。然而，甲醛抑制ACPS的功能，导致其活性有限，因此该途径尚未能在工业上用于甲酸盐利用。

甲酸盐利用的微生物工程策略

尽管通过代谢工程改造的底盘微生物能够利用甲酸盐，但其同化效率不足以满足工业生产的需求。因此，研究人员开发了一系列策略来优化甲酸盐同化的关键酶、途径和宿主微生物，最终实现从甲酸盐高产高附加值产品。

优化甲酸盐同化关键酶

提高FDH的效率

FDH是一种广泛存在于天然甲基营养微生物中的酶。为了在非甲基营养微生物中构建甲酸盐利用途径，常引入FDH来催化甲酸盐氧化成CO₂，促进辅因子再生，从而促进这些微生物的细胞生长和生产力。然而，FDH的主要局限性在于其活性和催化效率低，且稳定性差。提高FDH催化效率的策略包括：从天然甲基营养微生物中筛选高效FDH；通过定向进化构建FDH突变体库；通过定点突变提高FDH的催化效率和稳定性。

提高CA的效率

CA是一种含锌金属酶，在维持生物过程中起着关键的调节作用，主要负责催化CO₂的可逆水合反应。虽然CA不直接参与甲酸盐的同化途径，但它催化产生的碳酸氢根离子和氢离子会影响甲酸盐代谢途径中的酶活性或反应平衡。通过调节CA活性可以改善甲酸盐利用。蛋白质组学分析表明，与甲酸盐利用相关的CA可分为两类。提高这两种CA的活性是改善甲酸盐利用效率的关键。

优化GCS

GCS是一种多酶复合物，主要负责催化甘氨酸的分解代谢而非合成。在利用甲酸盐时，必须改变GCS的催化方向，但其催化效率受到严重限制。提高GCS活性的策略包括：利用基因编辑技术修饰菌株基因组，优化GCS的表达水平；采用共表达策略提高GCS活性。优化GCS对于甲酸盐利用具有重要意义，可使甲酸盐转化为中间代谢物，然后作为碳源进入代谢途径，促进微生物生长和产物合成。

优化甲酸盐同化途径

优化天然甲酸盐利用途径

通过调节甲酸盐利用途径中的代谢通量，可以促进微生物生长并利用甲酸盐作为碳源合成高附加值产品。优化天然途径的主要策略包括：通过基因工程策略修饰宿主微生物中甲酸盐利用途径的碳通量；通过各种组学分析揭示天然甲酸盐利用途径中的关键酶，并通过定向进化和突变筛选提高关键酶的活性和稳定性。

构建合成甲酸盐利用途径

为了提高甲酸盐同化途径的效率，在模式微生物中构建了合成甲酸盐利用途径。优化合成途径的策略包括：采用基因工程策略在模式微生物中构建甲酸盐同化途径；与其他途径协同作用。在非天然甲基营养微生物中建立甲酸盐同化途径是提高甲酸盐利用率和减少碳损失的高效策略。

设计人工甲酸盐利用途径

通过计算机辅助蛋白质工程设计，对关键酶进行定点突变；通过蛋白质设计和途径构建，合成从头甲酸盐同化途径。然而，甲酸盐同化途径的人工设计面临重大挑战，需要深入了解微生物的代谢和酶催化机制。建议使用多组学分析方法来设计和优化人工甲酸盐利用途径。

优化甲酸盐同化宿主

ALE

ALE是一种利用受控实验室环境模拟自然选择过程的方法，通过施加特定的环境压力促进微生物的适应性进化。ALE可用于改善菌株，提高宿主微生物在甲酸盐上的生长速率；也可用于通过碱基编辑工具提高对甲酸盐的耐受性。

共底物利用

共底物培养是通过将其他底物纳入同一生物反应过程以促进目标代谢和生产的可行策略。根据底物类型可分为两类：甲酸盐与其他碳源协同；甲酸盐与其他一碳化合物协同。通过利用共底物可以提高代谢效率和产物产量。

优化培养条件

优化培养基配方和温度是提高甲酸盐利用率的关键。优化培养基配方可以改善甲酸盐的共利用，促进微生物在葡萄糖限制条件下的代谢，提高产物合成效率。优化培养温度可以调节酶的表达水平，提高能量转换效率。此外，pH优化也至关重要，因为pH水平与酶活性相关。

技术经济分析和生命周期评估

为了评估甲酸盐作为工业应用可持续原料的可行性，需要进行系统的技术经济分析和生命周期评估。甲酸盐基生物制造在原材料成本、能耗和碳足迹方面具有诸多优势。在技术经济分析中，影响成本结构的关键因素包括甲酸盐的来源、转化效率、产物提取和设备投资。生命周期评估表明，与传统的石油化工原料相比，甲酸盐生物转化对环境的影响更小，温室气体排放和化石能源消耗更低。当甲酸盐生产由可再生能源驱动时，这一优势更加明显。然而，甲酸盐生物转化的技术成熟度目前有限，在扩大规模过程中的能效、副产物管理和系统集成方面面临的挑战需要进一步完善。

结论与展望

甲酸盐作为一种可持续原料，在工业制造生物燃料和生物化学品方面具有巨大潜力。目前，只有有限数量的天然微生物和合成微生物能够作为宿主利用甲酸盐。大多数这些微生物可以通过天然、合成和完全人工设计的甲酸盐同化途径来利用甲酸盐。此外，研究人员利用合成生物学和代谢工程等微生物工程策略提高了甲酸盐的利用效率。然而，在工业应用中仍存在一定的局限性，阻碍了甲酸盐的经济性发展，这对未来的研究提出了重大挑战。

在探索能够利用甲酸盐的微生物宿主方面，主要存在两个局限性：天然甲基营养微生物的生物学信息缺乏；天然甲基营养微生物可用的遗传操作工具有限。在优化甲酸盐同化途径时，其局限性主要来自途径的复杂性、酶的效率和环境影响。途径反应复杂，涉及多种酶和中间体；酶在实际应用中通常表现出不稳定和低效；某些途径产物谱系窄；副产物或抑制剂可能影响目标产物的合成；环境因素可能影响途径的效率和稳定性。在甲酸盐利用的微生物工程过程中，主要考虑因素是碳源竞争和能量转换效率。由于甲酸盐同化途径中的碳通量有限，合成甲基营养微生物难以仅依靠甲酸盐作为碳源和能源生长和生产；甲酸盐的能量转换效率可能不如其他碳源。

为了克服这些挑战，需要采用多组学技术来表征甲基营养微生物，阐明其遗传基础、基因表达模式、蛋白质功能和代谢途径；探索广泛应用