综述：人工酶电化学

《ChemElectroChem》：Artificial Enzymatic Electrochemistry

本综述系统阐述了人工酶电化学这一新兴交叉领域，重点介绍了通过直接电子转移（DET）和介导电子转移（MET）策略优化酶-电极界面，以提升人工酶在氢析出反应（HER）、氧还原反应（ORR）、CO2还原反应（CO2RR）等催化应用中的效率与稳定性，为未来高通量筛选和生物电合成提供了前瞻性展望。

　　

人工酶电化学：融合生物催化与电化学的新前沿

摘要

人工酶电化学作为一个新兴的交叉学科领域，旨在通过电化学方法扩展酶的催化能力，从而显著提高其选择性、效率，并解决稳定性、底物范围和反应规模等方面的局限性。这篇综述深入探讨了人工酶的设计策略、酶-电极接触方法以及关键的电化学技术，展示了该领域在能源转化和合成化学中的巨大潜力。

1 引言

酶作为生物催化剂，能够驱动化学反应以实现生物功能。将这些酶及其催化能力应用于工业和科学过程中，已成为一个重要的研究方向。酶电化学是一个日益重要的领域，它通过将酶整合到电子设备中，战略性利用其氧化还原活性和选择性，驱动细胞角色之外的催化过程。与电极耦合的酶在药物合成、能源生产、可再生材料生成和电化学传感等多种应用中至关重要。

天然酶可以高选择性和高效率地进行反应，并已证明其作为催化剂的实用性，但发现有用的非天然反应活性需要扩展到天然存在的酶之外。人工酶通过扩展酶的催化能力，进一步提高选择性和效率，并解决稳定性、底物范围和反应规模方面的限制，已成为一种有效的替代方案。

1.1 人工酶的分类

人工酶主要分为三大类：修饰的天然酶和氧化还原活性蛋白、被改变为具有酶活性的非催化蛋白，以及基于基本酶原理自下而上设计的从头酶（de novo enzymes）。这些类别的区别在于衍生人工酶的方法，但每种类型在其结构和设计中都包含蛋白质元素。

1.1.1 修饰的天然酶和氧化还原活性蛋白

这类酶和氧化还原活性蛋白在生物系统中天然存在，但经过修饰（超越简单的氨基酸点突变）以改变其天然能力，从而创造人工酶。最常见的修饰方式之一是用非天然辅因子替换活性位点的辅因子。

1.1.2 修饰的非催化蛋白

另一大类人工酶包括那些被修饰后变得具有催化活性的蛋白质，这些蛋白质最初并不催化反应或促进电子转移。迄今为止，最常用于此项研究的蛋白质是链霉亲和素（streptavidin），它作为引入非生物分子到蛋白质环境中的支架。

1.1.3 从头酶

从头（de novo）人工酶完全采用自下而上的方法设计，并非现有酶的修饰版本。计算方法被用于设计活性位点，对于预测酶的结构和功能至关重要。

1.2 人工酶设计策略

创造人工酶的方法多种多样，从单个氨基酸残基突变到自下而上的设计。通常，在人工酶设计过程中会采用多种策略，经过不同成功程度的尝试，直到最终的人工酶展现出必要的催化活性。最好的人工酶通常是通过多种方法的整合实现的。

1.2.1 理性设计

理性设计是创造人工酶的常用策略。这种方法利用酶结构和功能之间的关系来预测哪些变化可能产生具有所需特性的潜在突变体。

1.2.2 定向进化

定向进化（Directed Evolution, DE）是一种进一步增强和控制酶特性的策略。DE以更快的速度促进自然选择和进化，以产生具有所需特性的改进酶变体。

2 酶电化学：概念、方法与测量

随着酶电化学成为催化应用中更常见的方法，解决实验设计的实际方面和常见挑战非常重要，以便研究人员能够将这些技术纳入他们自己的工作中。酶自然比其他催化分子更复杂，需要额外的步骤来确保适当的电子转移。

2.1 电化学池概述

电化学池由各种组件组成，使得能够利用电能驱动化学反应，反之亦然。电解液溶液促进电荷在整个系统中的移动和转移。它由作为支持电解质的离子物种和可以溶解电解质以及任何其他共反应物或底物的溶剂组成。

酶电化学通常采用三电极设置，包括工作电极（WE）、对电极（CE）和参比电极（RE）。工作电极是发生电子转移的地方，用于监测目标反应。

2.2 酶-电极接触方法

促进酶和电极之间的电化学接触对于酶电催化至关重要，因为它使得酶反应能够被观察和控制。这通常是酶电化学设计中最困难的方面，促进酶和工作电极之间电子转移的两种主要方法是直接电子转移（DET）和介导电子转移（MET）。

2.2.1 直接电子转移

直接电子转移是酶能够在不借助其他材料的情况下，将电子从活性位点直接转移至电极或从电极接收电子的过程。DET使得能够同时阐明酶的反应速率和氧化还原电位，使其成为机理研究的有用分析工具。

2.2.2 介导电子转移

介导电子转移通常用于生物电化学，因为它可以通过利用小分子氧化还原介体将电荷运输到酶的活性位点，从而解决酶中电子转移的空间位阻限制。

2.2.3 DET与MET的关键比较

DET和MET方法在生物电化学中都得到高度应用，各有取舍和益处。虽然酶促DET的最高报道电流密度可以达到mA cm^?2量级，但大多数DET系统导致μA cm^?2的电流密度。相比之下，酶促MET方法始终产生更高的mA cm^?2电流密度。

2.3 电化学技术

有许多电化学技术可用于研究人工酶的反应速率和催化活性。通常，多种技术被用来研究酶和系统的不同方面。这些技术可以根据需要阐明的酶特性来选择，包括催化速率、反应机理、动力学参数、氧化还原态以及在不同条件（如温度、pH值和溶液变化）下的酶稳定性。

2.3.1 循环伏安法

循环伏安法是酶电化学最普遍的技术之一，因为它用于提供有关催化活性、电子转移机制、酶的氧化还原电位以及后续化学反应的信息。

2.3.2 光谱电化学

光谱电化学结合了光谱学和电化学，以分析特定电化学条件下的分子物种。该系统中获得的光谱信息受电位控制，为了解溶液中物种的 identity、运动、物理状态和数量提供 insight。

2.3.3 计时电流法

计时电流法用于通过监测电化学反应产生的电流作为时间的函数来检测和量化电化学反应。由于该技术采用固定电位，其简单性使其能够应用于从环境监测到生物医学应用的各种领域，并允许开发低成本的便携式设备。

3 人工酶在酶电化学中的应用

后续部分全面概述了人工酶电化学的研究工作。与酶电化学相比，人工酶电化学允许更大的可调性、增强的催化效率和更好的稳定性。这些优势可归因于酶的修饰，其中活性位点被修改以促进改进的电子转移，添加官能团以促进在电极上的固定化，或进行多轮定向进化以优化催化反应。

3.1 还原反应

讨论的还原反应包括氢析出反应、氧还原反应、CO₂还原、N₂O还原和超氧化物还原。对于每个部分，将人工酶催化剂的 key 性能指标与工业和酶催化剂的性能指标进行比较。

3.1.1 氢析出反应

氢是一种有前景的化石燃料替代能源，因为它不排放碳，并且副产物是水。然而，传统的制氢技术仍然需要化石燃料和基于化学的工艺，因此目前还不是一个可持续的过程。这促使研究人员研究光催化和电化学氢析出反应，其中H₂气体是通过在电极表面还原质子或水产生的。

3.1.2 氧还原反应

氧还原反应经常用于燃料电池中的能源生产，它是一个多电子、多步骤的反应，涉及将氧气还原形成水或过氧化氢。铂催化剂是最常用的催化剂之一，因为它们具有先例，但成本高且需要高过电位。

3.1.3 CO₂还原反应

CO₂还原反应是为了缓解气候变化而进行的，因为它们可以从大气中去除CO₂，同时产生有价值的产品，如一氧化碳、甲醇或乙醇。电化学CO₂RR允许温和的反应条件，可以与来自阳光的电力集成，并且已知可以将CO₂还原为有价值的化学品。

3.1.4 氧化亚氮还原

氧化亚氮还原是一个重要的过程，可以通过从大气中去除温室气体N₂O来帮助改善空气和水质。然而，将N₂O转化为N₂的过程极其困难。

3.1.5 超氧化物还原反应

超氧化物还原酶在生物系统中具有抗氧化作用，是中和有害活性氧的关键酶。这有助于保护生物体免受氧化损伤，通过催化超氧化物自由基还原为过氧化氢。

3.2 氧化反应

本节讨论的氧化反应包括氧析出反应和过氧化反应。作为氧化剂而非特定反应进行研究的人工酶的一个例子是Lu及其同事设计的一种二茂铁修饰的蓝铜蛋白酶。

3.2.1 氧析出反应

氧析出反应在可持续能源系统中用作阳极反应，这些系统产生氢和氧作为副产物，作为人工光合作用的组成部分帮助将CO₂转化为有用的产品，并用于燃料电池中的能量存储。然而，OER通常是这些设备的限速步骤，因此研究人员转向酶来帮助使该反应更有效，并已使用人工酶来实现OER的增强反应性。

3.2.2 过氧化反应

过氧化物酶是一类氧化还原酶，它利用H₂O₂作为电子受体来氧化底物，并在此过程中产生水。过氧化物酶天然含有一个血红素基团，存在于植物、动物和微生物中，以帮助保护细胞免受氧化应激和细胞损伤。

3.3 酶促电合成

电化学方法可以与合成技术相结合，为各种应用（包括H₂、O₂和Cl₂的析出）中形成或断裂键提供必要的电子。通过利用电力，电有机化学最大限度地减少了对刺激性化学品和条件的需求，并通过使用电子作为试剂来减少反应和纯化步骤的数量，从而简化了反应路径。

3.3.1 碳-碳键形成

碳-碳键形成是一个特别受关注的合成反应，因为它能够通过形成碳键来形成复杂的分子；然而，由于选择性和动力学限制方面的挑战，这个过程本质上是困难的。

3.3.2 环氧化反应

环氧化反应用于通过向烯烃添加氧原子来形成高反应性的三元环，用于合成过程。苯乙烯常用于环氧化反应生产苯乙烯氧化物，苯乙烯氧化物用作合成香料、增塑剂、药物、甜味剂和精细化学品的中间体。

3.4 结构性人工酶电化学

虽然许多人工酶被设计来模拟天然存在的酶，如前面部分所示，但有些酶的设计更普遍地是为了研究氧化还原特性和特征，本节中研究每个人工酶所用的氧化还原电位和电化学方法包含在表2中。

3.5 从头酶电化学

大多数从头酶利用电化学来研究人工酶的基本氧化还原特性，并且除了表征之外的研究有限。这些人工酶通常可以执行简单的电子转移反应，并证明其作为催化剂的潜在可行性；然而，大多数无法与天然和理性设计的酶相媲美，并且需要优化才能用于反应。

4 人工酶电催化的展望与未来方向

虽然人工酶方法在基础研究和工业应用中不再陌生，但人工酶的电化学利用仍然相对不发达。许多人工酶的电化学研究仅限于氧化还原表征或不同变体催化行为的比较。令人惊讶的是，电化学并非人工酶表征的主要手段，因为它具有以下优势：1）无需荧光标记或次级酶测定即可直接读取酶活性；2）将高选择性酶生物催化与工业脱碳和电气化努力相结合；3）为先进生物传感器提供简单的信号转导。基于这些优势，我们概述了未来将电化学与人工酶整合所需发展的三个领域。

4.1 用于人工酶的高通量电化学方法

在人工酶化学中采用电化学方法的最显著障碍历来是电化学的低通量实验，即一次只能研究一种酶。这种低通量状态使得电化学不适合现代酶学研究，现代酶学研究经常需要筛选10⁵–10⁸个突变体或条件。

4.2 人工酶的有机电合成方法

电化学和酶生物催化已成为工业和制药合成中的主流方法。电化学通过电子转移为自由基中间体提供了简单且可持续的途径，这使得大量有用的交叉偶联方法成为可能。虽然强大，但许多这些方法仍然因自由基副反应而导致选择性低。或者，人工酶生物催化通过其活性位点的受控空间和化学环境为合成转化提供了高的区域、化学和对映选择性。

4.3 增强直接电子转移的人工酶设计

酶电化学最困难的方面之一是在电极和酶辅因子之间可靠地建立电子转移。介导方法提供了促进电子转移的简单通用方法，但直接电子转移仍然是最理想的方法，因为它能够为燃料电池实现快速简单的催化，并为生物传感器提供信号转导。

结论

人工酶电化学作为一个强大的工具，正在推动生物催化与电化学的深度融合。通过理性设计、定向进化及先进的电化学技术，研究者能够精确调控人工酶的催化性能，并将其应用于能源转化、环境修复及精细化学品合成等领域。未来，随着高通量筛选、计算设计及电极界面工程的进一步发展，人工酶电化学有望在可持续化学合成和生物传感中发挥更重要的作用。