BolAG-BolRPI2-BolBAM4模块通过调节西兰花（Brassica oleracea var. italica）中的淀粉代谢来控制凝乳的形成过程

《Plant Biotechnology Journal》：BolAG-BolRPI2-BolBAM4 Module Regulates the Bolting of Curd by Modulating Starch Metabolism in Broccoli (Brassica oleracea var. italica)

花椰菜球发育受BolAG调控，其过表达促进早熟bolting并加速淀粉代谢，通过直接激活BolBAM4降解基因及与BolRPI2相互作用增强淀粉降解途径，而RNAi抑制则导致发育延迟。淀粉合成与降解的平衡影响bolting时间，为农业改良提供理论依据。

　　本研究围绕花椰菜（*Brassica oleracea* var. *italica*）的花序结构“花球”的发育机制展开，特别是花球过早抽薹现象对产量和商品价值的影响。花球作为花椰菜最核心的可食用器官，其发育过程受到多种因素的调控，而目前对这一过程的分子机制仍缺乏深入理解。本研究首次发现了一种名为 *BolAG* 的基因，该基因与拟南芥中的 *AtAG* 基因同源，主要在花球和花器官中高度表达。通过对 *BolAG* 进行转基因过表达和RNA干扰实验，研究发现该基因显著促进花球的发育，并导致抽薹时间提前；而 *BolAG* 表达被抑制的植株则表现出花球发育停滞，导致抽薹延迟甚至缺失。生理分析表明，*BolAG* 过表达的植株表现出更高的淀粉和可溶性糖含量（SSC），并且RNA-Seq分析显示与淀粉代谢相关的基因显著富集。其中，淀粉水解相关基因 *BolBAM4* 被确认为 *BolAG* 的靶基因。此外，*BolAG* 被证实与核酮糖-5-磷酸异构酶2（*BolRPI2*）相互作用，而这种相互作用增强了 *BolAG* 对 *BolBAM4* 的转录促进作用，加速了淀粉的分解，从而导致可溶性糖的积累。尽管 *BolRPI2* 被证明对叶绿体功能有促进作用，并有助于淀粉的合成，但 *BolAG* 似乎通过 *BolRPI2* 独立的方式促进淀粉的合成。这些结果表明，*BolAG-BolRPI2-BolBAM4* 模块在调控淀粉代谢中起着关键作用，为解决因过早抽薹造成的工业损失提供了理论基础。

花椰菜作为十字花科中重要的蔬菜作物，具有较高的营养价值和健康价值。其可食用器官——花球，由大量短枝组成，形成一个不定型的花序结构。花球的发育模式及其影响因素一直是研究的重点，尤其在与花椰菜亲缘关系密切的花椰菜（*Brassica oleracea* var. *botrytis*）中已有大量研究。早期研究表明，*BobAP1* 和 *BobCAL* 是控制花椰菜花球发育终止的主要调控因子。基因组比较显示，花椰菜与甘蓝之间的结构变异可能涉及一些负调控基因，如 *BobAGL14*、*BobSVP* 和 *BobCCE1*。对于花椰菜中特有的螺旋状花序结构，构建了一个SALT网络（SAX、AP1/CAL、LFY和TFL1）来解释花球的形成和发育。在甘蓝的全基因组中，研究发现 *BoFLC2* 在春化和开花分化中起关键作用，而 *BoFLC3* 的第一内含子中存在39个变异，参与了花椰菜开花过程的精细调控。此外，还构建了一个由2741个SNP组成的高密度遗传图谱，用于研究花序发育的终止过程，揭示了花球形成和发育受到多个基因的复杂调控机制。然而，目前对花椰菜和花椰菜花球形成和发育的分子机制仍然模糊。

抽薹是某些植物在开花前花茎伸长的现象，这一过程由自主发育调控和环境因素如温度、光周期和植物激素共同影响。高温会加速生菜的抽薹，导致叶片苦涩，降低其商品价值。敲低 *LsFT* 和 *LsSOC1* 基因显著延迟了生菜的抽薹时间，并使其对高温不敏感。在 *Angelica sinensis* 中，过早抽薹会导致营养从根部向生殖器官转移，引起根部木质化，从而降低其药用价值。在 *Brassica* 属的芥菜和甘蓝中，抽薹时间也严重影响收获产品的产量和品质。研究表明，通过构建连锁图谱和分析QTL（数量性状位点）可以鉴定出与抽薹时间相关的候选基因，如 *FLC* 和 *FT*。此外，植物激素如赤霉素、生长素和脱落酸也被认为是调控抽薹和开花的重要因子。在花椰菜中，花球的抽薹时间影响其成熟度、采收时间和花球的紧密程度。过早抽薹是直接影响花椰菜品质和经济价值的关键因素之一，但其调控机制仍然有限。

MADS-box转录因子（TFs）在确定花器官身份、调控果实、种子、叶片和根部的发育中起着至关重要的作用。其中，类C MADS-box基因 *AGAMOUS*（*AG*）参与调控花器官身份、花序分生组织的确定性以及果实发育。在拟南芥中，*LEAFY*（*LFY*）和 *WUSCHEL*（*WUS*）这两个转录因子能够结合 *AG* 的第二内含子，激活其表达。*AG* 可以招募 *CURLY LEAF*（*CLF*）来甲基化并失活 *WUS*，同时激活 *KNUCKLES*（*KNU*）的表达，该基因在花序发育的第六阶段抑制 *WUS* 的表达，从而终止未分化细胞的增殖。在这一阶段，*AG-WUS-KNU* 模块精确地控制花序分生组织干细胞的维持。尽管 *AG* 在模式植物如拟南芥中被广泛研究，但其在花椰菜中的功能仍不清楚。

植物通过营养供应协调生长和发育过程。光合作用产生的糖类不仅作为能量来源，还调控植物的生长和开花转换。在开花作物中，抽薹时间直接决定了植物的形态和产量，而糖类在开花过程中起着关键作用。研究表明，糖类不仅在苹果、葡萄和柑橘中作为能量来源，还作为信号分子参与开花诱导。此外，来自“源”叶片的糖信号被运输到顶芽分生组织（SAM）并整合到开花路径中，其中 *AtIDD8* 转录因子通过调控糖的运输和代谢来调节开花时间。同时，关键的淀粉合成酶基因 *Granule-Bound Starch Synthase 1*（*GBSS1*）通过调控 *CONSTANS*（*CO*）基因的表达，促进开花。淀粉是植物中主要的碳水化合物能量储备，在白天合成，夜间分解。淀粉分解为植物的生长和发育提供必要的能量，影响植物的结构、形态和环境适应能力。然而，淀粉代谢对花椰菜花球发育的影响仍有限。

本研究旨在阐明花椰菜花球发育的内部调控机制，调查了 *BolAG* 基因的功能，该基因是拟南芥 *AtAG* 的同源基因，此前被报道参与花器官的发育。研究鉴定了 *BolAG* 的下游靶基因，并发现了与 *BolAG* 相互作用的蛋白质。值得注意的是，一个以 *BolAG* 为中心的新基因模块被揭示，该模块调控淀粉代谢并起着关键作用，尤其是在抽薹过程中。这些发现为花椰菜花球发育的调控机制提供了新的见解。

研究发现，*BolAG* 在花球和花器官中高度表达，并且对糖类具有敏感性。转基因花椰菜植株中 *BolAG* 过表达和RNA干扰实验显示，过表达株系的 *BolAG* 转录水平比野生型（WT）高出五倍以上，而RNAi株系的 *BolAG* 表达量则比野生型降低超过80%。在田间移栽后，野生型花椰菜表现出正常的花球发育，而RNAi株系在早期阶段出现发育停滞，导致花球较小。相反，*BolAG* 过表达植株表现出过早抽薹的表型。*BolAG* 过表达植株的抽薹时间平均比野生型提前18天，而RNAi株系则比野生型晚13天。此外，*BolAG* 过表达株系的主级侧花茎长度约为野生型的两倍，而RNAi株系的主级侧花茎则较短。进一步分析不同抽薹时间的花椰菜品种显示，早抽薹（EB）品种的 *BolAG* 表达水平显著高于晚抽薹（LB）品种。这些结果表明，*BolAG* 是调控花球发育和抽薹的关键调控因子。

在花球发育过程中，*BolAG* 过表达显著促进淀粉的合成和分解，导致花椰菜中可溶性糖的积累。研究还发现，*BolAG* 过表达影响了与淀粉代谢相关的基因表达，包括 *BolGBSS1* 和 *BolAPL3*，而这些基因在 *BolAG* 表达被抑制的植株中则显著下调。进一步的转录组分析表明，*BolAG* 过表达显著调控与膜完整性、膜组分、碳水化合物代谢和光合系统相关的基因表达。这些结果表明，*BolAG* 与淀粉代谢密切相关。

研究发现，*BolAG* 过表达显著上调了淀粉分解基因 *BolBAM4* 的表达，而 *BolAG* 表达被抑制的植株则显著下调该基因的表达。*BolBAM4* 在花球、花器官和种子中均表现出高表达。通过酵母单杂交（Y1H）实验，证实 *BolAG* 能够直接结合 *BolBAM4* 的启动子区域。此外，构建了一个由 *BolBAM4* 启动子驱动的GUS报告基因载体，并与 *BolAG* 表达载体共同转染，进一步验证了 *BolAG* 对 *BolBAM4* 的转录激活作用。实验结果显示，与 *BolBAM4* 启动子连接的 *LUC* 基因在 *BolAG* 共表达的情况下表现出显著的荧光活性，而对照组则没有。这些结果表明，*BolBAM4* 是 *BolAG* 的下游靶基因，*BolAG* 直接结合其启动子并正向调控其转录表达。

*BolAG* 与 *BolRPI2* 之间的相互作用被进一步验证。通过酵母双杂交（Y2H）实验，研究发现 *BolAG* 与 *BolRPI2* 之间存在显著的相互作用。同时，*BolAG* 促进 *BolRPI2* 的核定位。通过双分子荧光互补（BiFC）实验，证实 *BolAG* 与 *BolRPI2* 在细胞核中相互作用并共定位。然而，当仅使用 *BolRPI2* 的融合载体注射到烟草叶片时，*BolRPI2* 被发现同时定位于细胞质和细胞核中。这些观察表明，*BolAG* 通过促进 *BolRPI2* 的核定位，增强了其在花球发育中的作用。

研究还发现，*BolRPI2* 通过调控叶绿素合成基因 *BolHEM1* 和 *BolGSA1* 增加了叶绿素含量，并影响了叶绿体功能。*BolRPI2* 过表达的植株表现出更强的叶绿体功能，叶绿体的大小和数量均增加，同时促进了淀粉的合成和可溶性糖的积累。相反，*BolRPI2* 表达被抑制的植株则表现出叶绿素含量减少和叶绿体发育受阻。此外，*BolRPI2* 过表达的植株在抽薹过程中表现出更早的花球形成和主级花序分生组织的提前伸长，表明抽薹过程的早期启动。相比之下，RNAi- *BolRPI2* 株系表现出延迟的花球成熟，伴随过度的叶丛增殖。这些结果表明，*BolRPI2* 与 *BolAG* 在调控花球发育过程中具有相似的功能，通过促进花序和花序分生组织的分化来实现。

*BolAG* 通过直接调控 *BolRPI2* 的启动子区域，对其表达具有抑制作用。这一发现通过酵母单杂交实验和双荧光报告基因实验进一步验证。*BolAG* 与 *BolRPI2* 的相互作用增强了其对 *BolBAM4* 的转录激活作用，从而加速淀粉的分解，导致可溶性糖的积累。同时，*BolAG* 通过上调淀粉合成基因 *BolGBSS1* 和 *BolAPL3* 的表达，独立于 *BolRPI2* 的作用，促进淀粉的合成。这些结果表明，*BolAG* 的调控作用主要通过直接调控淀粉合成相关基因实现，与 *BolRPI2* 的作用无关。

基于这些发现，研究提出一个新的调控机制模型，其中 *BolAG-BolRPI2-BolBAM4* 模块通过调控淀粉代谢影响花椰菜的抽薹时间。*BolAG* 过表达促进淀粉代谢，通过增强 *BolBAM4* 的表达导致抽薹时间提前。*BolRPI2* 与 *BolAG* 的相互作用增强了其对 *BolBAM4* 的转录激活作用，从而加速淀粉代谢。同时，*BolAG* 通过上调淀粉合成基因 *BolGBSS1* 和 *BolAPL3* 的表达，独立于 *BolRPI2* 的作用，促进淀粉的合成。这些结果确认了 *BolAG-BolRPI2-BolBAM4* 模块在调控淀粉代谢、影响抽薹时间中的关键作用。尽管本研究主要关注发育调控，但基因改造对营养品质的潜在影响仍需进一步研究。