工程化皮层网络：一个用于体外控制人类神经回路形成和突触分析的开放平台

《Advanced Healthcare Materials》：Engineering Cortical Networks: An Open Platform for Controlled Human Circuit Formation and Synaptic Analysis In Vitro

人类诱导多能干细胞（iPSC）衍生的皮质神经元在新型开放式生物工程平台BioConNet上的精准调控与功能连接研究。通过PDMS微沟槽拓扑结构和可拆卸细胞定位装置，实现神经元节点的可控组装与轴突方向性引导。平台支持双节点电路构建，证实了跨节点突触连接的形成（PSD95和Synaptophysin共定位验证），并展示了光遗传学调控下功能性网络活动的动态特性。结合蛋白质组学分析，该平台为皮质电路的分子机制研究和神经退行性疾病建模提供了高兼容性工具。

　　本研究聚焦于构建一种新的开放式神经网络平台，以更好地模拟人类大脑的神经元连接方式，从而更深入地理解神经网络的形成和功能。传统上，研究神经网络主要依赖于二维培养系统或封闭式微流控技术，但这些方法在精确控制神经元连接结构和进行大规模分子分析方面存在局限。为了克服这些限制，研究人员开发了一种名为BIOCONNET的平台，该平台结合了诱导多能干细胞（iPSC）衍生的神经元和生物工程手段，实现了神经网络的灵活构建与控制。

神经网络是大脑功能的核心组成部分，它们通过特定的神经元类型之间的连接来组织。这些网络的形成对于理解与脑部疾病相关的机制至关重要。然而，现有的模型在模拟真实大脑中的神经元连接和活动依赖性过程时存在挑战。iPSC模型虽然可以用于研究人类神经元的发育和疾病机制，但由于缺乏精确的结构控制，难以深入探讨具体的神经元相互作用和活动相关过程。而微流控技术虽然提供了结构上的控制，但由于其封闭性，限制了三维网络整合、可扩展性和细胞回收。因此，为了更好地模拟大脑的复杂结构和功能，研究团队开发了一种新的开放式平台，使得神经元可以在更大的尺度上被研究，并且能够进行多种分子分析。

该平台基于聚二甲基硅氧烷（PDMS）微沟槽拓扑结构和细胞接种引导装置，构建了“神经元节点”，从而在开放系统中实现了灵活的网络构建。这种设计不仅允许通过光遗传学手段调控神经活动，还支持对网络结构进行灵活的修改，包括细胞组成、神经突方向性和突触形成。开放设计使得神经元材料的回收成为可能，从而支持对皮质网络的多层次分析，如蛋白质组学研究。这为研究正常和病理状态下的神经网络提供了新的工具，有助于探索与连接丧失相关的分子变化。

在构建该平台的过程中，研究团队首先开发了一种基于PDMS的微拓扑表面和一个细胞接种引导装置。这些装置通过软光刻技术和3D打印模具制造，能够引导细胞在特定区域聚集并形成神经元节点。细胞在接种前经过氧气等离子体处理，以增强PDMS的亲水性，从而促进液体和细胞的分布。通过将细胞接种到特定位置，研究团队能够实现对神经元位置的精确控制，并在细胞聚集后移除接种装置，形成一个开放的培养系统，使得神经元可以在培养过程中自由移动。通过调整细胞接种时间，研究团队发现48小时的接种时间能够平衡细胞聚集和神经突的生长，从而优化节点的形成。

此外，研究团队还探讨了不同细胞数量对单个、紧凑神经元节点形成的影响。通过应用六边形堆叠原理，计算了在不同六边形堆叠密度下细胞数量的最优配置。结果表明，至少需要8倍的六边形堆叠密度才能形成稳定的神经元节点。同时，研究团队还分析了不同宽度的细胞接种装置对节点形状稳定性的影响，发现一个合适的宽高比（20）能够有效引导神经元形成线性结构。这些发现为构建复杂的神经网络提供了基础。

为了进一步增强节点的结构稳定性，研究团队引入了星形胶质细胞。星形胶质细胞在神经系统中发挥重要作用，能够通过分泌细胞外基质（ECM）成分支持神经元的稳定性和功能。结果显示，整合星形胶质细胞的神经元节点表现出更好的结构稳定性和细胞附着能力，同时也促进了神经元功能的成熟。星形胶质细胞的存在使得神经元在培养过程中保持更紧密的排列，减少了节点的收缩，并提高了突触形成的可能性。

研究团队还测试了不同微拓扑设计对神经突方向性的影响，特别是T型连接结构。通过在T型连接处设置不同的微沟槽宽度，研究团队观察到神经突在T型连接处的转向行为。结果显示，250微米的沟槽设计最有效地引导神经突在T型连接处交叉，而500微米的沟槽设计则更好地限制了神经突在T型连接区域的扩散。这种T型连接设计使得神经突能够跨越不同的节点，形成潜在的突触连接，从而支持对神经网络形成和功能的深入研究。

为了进一步验证该平台的功能，研究团队还整合了光遗传学工具，以实现对神经元活动的精确调控。通过在上层节点中引入表达ChrimsonR的神经元，研究团队能够使用红光刺激这些神经元，从而观察其对下层节点神经元的影响。结果表明，上层节点的神经元在光刺激后表现出更有序的钙信号活动，而下层节点的神经元则显示出更多的活动变化，表明神经突之间的连接对神经元活动模式有显著影响。这一发现进一步证明了该平台在研究活动依赖性过程中的潜力。

此外，该平台还支持大规模的蛋白质组学分析。通过分离特定的网络区域，如T型连接处、节点1和节点2，研究团队能够进行蛋白质提取和质谱分析。结果表明，T型连接处的蛋白质表达与突触形成密切相关，显示出显著的蛋白质富集。这些发现为研究突触相关蛋白的表达提供了新的工具，并且支持对突触连接和网络功能的深入分析。

研究团队还讨论了该平台在疾病建模中的应用。由于微流控系统缺乏开放性，限制了对大规模细胞材料的处理和分析，而BIOCONNET平台则克服了这一限制。该平台能够用于研究神经退行性疾病中突触丢失和网络功能障碍的机制，为探索疾病相关的分子和细胞变化提供了新的途径。尽管该平台在某些方面仍存在局限，如无法提供不同的培养条件和可能的细胞迁移问题，但通过优化细胞接种条件和应用特定的预处理策略，可以缓解这些问题。

总之，BIOCONNET平台代表了一种新的工具，能够更有效地研究神经网络的形成和功能。它不仅能够构建和调控大规模的神经网络，还支持多种分子分析，如蛋白质组学和转录组学。这一平台为理解大脑健康和疾病提供了新的机会，并为未来的神经科学研究奠定了基础。未来的研究可以进一步探索该平台在更复杂的神经网络构建中的应用，如引入抑制性神经元，以研究兴奋性与抑制性神经元之间的平衡。此外，该平台的灵活性还可以用于构建更复杂的网络结构，从而更全面地理解大脑功能的多层次组织和调控机制。