利用微针中的Paralicheniformis芽孢杆菌实现原位生物聚合物生产的生物材料方法

《Advanced Healthcare Materials》：Living Materials Approach for In Situ Bio-Polymers Production Using Bacillus Paralicheniformis in Microneedles

活体微针贴系统封装产γ-PGA的非致病性芽孢杆菌B. paralicheniformis，经微针穿刺皮肤角质层后释放细菌并持续分泌高分子量γ-PGA，在体实验显示无炎症且有效驻留。

　　这项研究介绍了一种新型的“活体微针贴片”系统，该系统通过将一种非致病性、革兰氏阳性细菌 *Bacillus paralicheniformis*（*B. paralicheniformis*）与传统高分子支架材料结合，实现了在皮肤中对γ-聚谷氨酸（γ-PGA）的现场合成与释放。这种“活体制造商”概念的核心在于利用活体细菌的代谢能力，在体表环境中持续生成具有生物活性的高分子材料，从而为慢性或急性皮肤疾病提供更有效的治疗手段。与以往的系统不同，该研究首次实现了高分子量生物聚合物的皮肤内原位合成，为未来皮肤治疗领域开辟了新的可能性。

### 活体材料与皮肤治疗的结合

活体材料的概念是指将活体生物体，如细菌或细胞，与传统生物材料相结合，形成具有功能性和响应性的结构。这种技术的核心在于赋予材料“活性”，使其能够在体内或体表环境中根据环境变化进行反应，如合成特定的生物分子或调节细胞行为。γ-PGA作为一种具有高水分子结合能力的生物聚合物，已被广泛研究用于皮肤治疗，例如作为止血黏合剂和改善皮肤水分保持及减少皱纹的活性成分。然而，传统的γ-PGA合成方法通常依赖于实验室环境，而该研究则提出了一种创新的方法，通过将γ-PGA的合成过程转移至皮肤内部，实现更持久的生物分子作用。

### 微针系统的构建与功能

微针贴片是一种能够穿透皮肤角质层而不损伤血管和感觉神经的无痛给药系统。其设计目标是将细菌包裹在微针中，并在应用后实现细菌的释放与γ-PGA的持续合成。研究人员选择了 *B. paralicheniformis* 作为γ-PGA的生产菌株，因为它能够利用L-谷氨酸进行代谢，并通过特定的酶系统将L-谷氨酸转化为γ-PGA。微针由聚乙烯醇（PVA）和聚乙烯吡咯烷酮（PVP）的混合物构成，这两种材料具有良好的机械强度和水溶性，能够支持细菌的稳定包裹，并在体内遇水后迅速溶解，释放出细菌。

通过微模塑技术（micromolding technique），研究人员成功制备了含有 *B. paralicheniformis* 的微针贴片。实验结果显示，含有细菌的微针在结构上与不含细菌的微针相似，说明细菌的包裹对微针的形态和机械性能影响较小。此外，通过扫描电子显微镜（SEM）和共聚焦显微镜（SDC）的观察，细菌在微针内部分布均匀，且在释放后能够迅速扩散并开始代谢活动。

### 细菌释放与生长条件的优化

为了评估微针贴片对细菌释放和生长的影响，研究人员测试了不同的营养培养基，包括Luria-Bertani（LB）培养基、E培养基和ATCC #21培养基。实验发现，LB培养基支持细菌的快速生长，其生长曲线表现出较短的滞后期（约10小时）和较高的指数增长速率（0.41 /小时），最终达到约1.7 OD600的高细胞密度。相比之下，E培养基虽然不支持细菌的快速增殖，却显著促进了γ-PGA的合成，其产量约为2.6 ± 0.5 mg/mL，而LB培养基中γ-PGA产量仅为0.51 ± 0.14 mg/mL。这一结果表明，不同的培养基对细菌的代谢路径有显著影响，其中LB培养基富含多种营养物质，适合细菌生长，而E培养基中较高的L-谷氨酸浓度则更有利于γ-PGA的合成。

在微针系统中，研究人员选择1:1的细菌与聚合物比例作为最优配置。这一比例不仅保证了细菌的充分释放，还维持了微针的机械稳定性。通过细胞计数和光学密度检测，研究人员确认了该比例下细菌的生长和γ-PGA的合成效率较高。此外，该系统在体外和体内均表现出良好的生物相容性，细菌在皮肤中成功定植，且未引发任何炎症或组织损伤。

### γ-PGA的结构分析与功能验证

为了验证γ-PGA的结构和功能，研究人员采用了多种分析技术。通过核磁共振（NMR）和傅里叶变换红外光谱（FTIR）等方法，确认了γ-PGA的化学结构特征。例如，NMR光谱中出现了典型的α-CH、β-CH2和γ-CH2信号，而FTIR光谱则显示了与γ-PGA相关的官能团特征，如O─H、N─H、C─H、C═O和C─O的伸缩振动。这些结果表明，微针系统中释放的γ-PGA具有与实验室合成一致的结构特性。

此外，研究人员通过凝胶渗透色谱（GPC）测定了γ-PGA的分子量范围，发现其分子量在64,000到563,000 Da之间，与文献报道的 *Bacillus* 属细菌合成的γ-PGA分子量范围相符。这进一步证明了微针系统在体内合成高分子量γ-PGA的能力。为了验证γ-PGA在皮肤中的存在，研究人员使用了鞣酸（tannic acid）进行反应，结果显示含有细菌的微针贴片能够形成不溶于水的凝胶结构，而对照组则没有此类现象。

### 体内安全性与生物相容性评估

为了确保该系统的安全性，研究人员进行了体内毒性评估和皮肤定植研究。实验中使用了16只8周龄的C57BL/6雌性小鼠，将其分为两组：一组接受含有 *B. paralicheniformis* 的微针贴片，另一组接受不含细菌的微针贴片。在应用微针贴片后，研究人员通过组织学分析（H&E染色）和电子显微镜观察，确认了皮肤组织的结构完整性，未发现炎症细胞浸润、水肿或表皮增厚等不良反应。这表明该系统在体内具有良好的生物相容性。

为了进一步验证细菌的定植能力，研究人员使用了聚合酶链式反应（PCR）检测皮肤样本中的 *B. paralicheniformis*。通过针对BALI_RS06210基因（一种特异性编码锰催化酶的基因）的引物扩增，研究人员成功检测到了含有细菌的微针贴片在皮肤中的存在。而在对照组中，未检测到任何细菌信号，这说明该系统在体内具有选择性释放和定植能力，不会对宿主的原生微生物群造成干扰。

此外，研究人员还观察了微针贴片在体内的降解过程。实验结果显示，微针贴片在体内2小时内即可完全降解，且降解过程不影响其在皮肤中的功能表现。这表明该系统在使用后能够安全地降解，避免了长期残留带来的潜在风险。

### 未来展望与应用潜力

该研究提出的微针贴片系统不仅能够实现γ-PGA的现场合成，还具有良好的机械性能和生物相容性，为慢性或急性皮肤疾病的治疗提供了新的思路。与传统的外用制剂相比，该系统能够更有效地将生物分子输送到皮肤深层，延长其在体内的作用时间。同时，由于微针贴片无需复杂的注射设备，具有操作简便、无痛、可重复使用等优势，因此在临床应用中具有广阔前景。

此外，该研究还探讨了未来可能的改进方向。例如，采用更先进的微针制备技术，如脉冲式原位干燥电拉伸（Pulsating In Situ Dried Electrostretching）或可拉伸的微针贴片（Stretchable MN Adhesive Patches），可以进一步提高微针的皮肤穿透能力和生物分子的释放效率。这些改进可能使该系统更适用于大规模生产和临床应用。

综上所述，这项研究展示了一种基于 *B. paralicheniformis* 的活体微针贴片系统，能够实现γ-PGA的现场合成与释放，具有显著的治疗潜力。该系统不仅在体外表现出良好的机械性能和细菌释放能力，而且在体内验证了其安全性与生物相容性。未来，随着技术的进一步优化和应用拓展，这种“活体制造商”系统有望成为治疗皮肤疾病的新范式，为生物医学领域带来革命性的突破。