一种差异深度测序方法SPRE-Seq，用于提高基于杂交捕获的下一代测序（NGS）技术中目标区域的覆盖度

《Engineering in Life Sciences》：A Differential Depth Sequencing Method, SPRE-Seq, for Enhancing Targeted Region Coverage in Hybridization Capture-Based NGS

SPRE-Seq是一种通过streptavidin预阻断探针实现靶向测序深度差异化的方法，在HRD和HRR检测中仅需原数据量50%（6GB vs 12GB）即可达到同等检测效果，准确率100%。

　　本研究探讨了一种创新的下一代测序（NGS）方法——SPRE-Seq（Specific-Regions-Enriched sequencing via streptavidin pre-blocked partly oligonucleotide probes），旨在通过在特定区域实现差异化的测序深度，提升基因组变异检测的准确性与效率。随着NGS技术的不断进步，其在生物学研究和临床诊断中的应用日益广泛，尤其是在肿瘤基因组学、遗传病诊断以及个性化医疗等领域。然而，传统的NGS方法在测序深度与测序广度之间存在明显的权衡，这限制了其在某些高精度需求场景下的应用。例如，在需要检测低频突变或罕见变异的病例中，为了提高检测的可靠性，通常需要增加测序深度，但这又会导致测序广度的下降，从而影响对更多基因或样本的覆盖能力。因此，如何在有限的测序数据量下，实现对关键基因区域的高深度测序，同时保证其他区域的测序质量，成为研究的一个重要方向。

SPRE-Seq的核心原理是通过使用部分预阻断的探针，对不同区域的测序深度进行差异化调控。具体来说，该方法利用了生物素与链霉亲和素之间的高亲和力结合特性。在构建测序探针时，针对那些对测序深度要求较低的区域，将部分探针预先与链霉亲和素结合，从而降低这些区域的测序覆盖，而对高深度要求的区域则保留未被阻断的探针，确保其获得足够的测序深度。这种方法在不增加整体测序数据量的前提下，实现了对关键基因区域的深度覆盖，同时减少了对非关键区域的测序负担，从而在成本和效率之间取得了良好的平衡。

在本研究中，SPRE-Seq被应用于我们自主设计的同源重组缺陷（HRD）检测实验。HRD检测通常涉及两个部分：一是同源重组修复（HRR）基因的突变检测，二是通过基因组疤痕（genomic scars）评估HRD状态。HRR基因的突变对于判断HRD状态具有重要意义，因为这些突变往往与DNA修复功能的缺失相关，而HRD状态则可以作为某些癌症治疗反应的预测指标。因此，准确识别这些区域的变异对于临床诊断和治疗决策具有关键作用。通过SPRE-Seq方法，我们成功地在减少一半的测序数据量（从12 GB降至6 GB）的情况下，达到了对HRR和HRD区域的预期测序深度要求，并且所有七种HRD参考标准的检测结果与预期完全一致，显示了该方法的高度可靠性。

在临床样本的测试中，SPRE-Seq同样表现出优异的性能。我们对29例卵巢癌患者的FFPE（福尔马林固定石蜡包埋）样本进行了分析，比较了使用传统探针（control-12G组）和SPRE-Seq探针（pre-blocked-6G组）的测序效果。结果显示，使用SPRE-Seq方法，尽管测序数据量减少了一半，但HRR区域的有效测序深度仍然保持在较高水平，且与传统方法相比，其捕获效率显著提高。同时，HRD区域的有效测序深度虽有所下降，但并未影响其分类的准确性。所有样本的HRD状态检测结果在SPRE-Seq组与传统组之间均达到100%的一致性，而在SPRE-Seq组与传统低数据量组（control-6G组）之间，一致性也达到了93.13%。这表明，即使在减少数据量的情况下，SPRE-Seq仍能提供足够的信息量以支持准确的HRD状态判断。

此外，我们还对三组样本的变异检测结果进行了比较。结果显示，SPRE-Seq方法在检测HRR基因的体细胞变异方面与传统方法具有高度一致性，仅在少数样本中发现了一些差异。这些差异主要出现在变异等位基因频率（VAF）接近检测灵敏度阈值的区域，这可能是由于测序深度不足导致的随机误差。值得注意的是，所有差异变异均通过生物信息学工具进行了验证，确认其为真实存在的变异，而非假阳性结果。这一发现进一步证明了SPRE-Seq在实际应用中的稳健性。

从技术实现的角度来看，SPRE-Seq的探针设计和预处理过程是关键步骤。我们首先设计了针对HRR基因的探针，并结合了针对HRD区域的探针。为了实现差异化的测序深度，我们对HRD探针进行了部分预阻断处理，通过调整链霉亲和素的添加量，使得不同区域的测序深度得以控制。在实验中，我们测试了多种链霉亲和素体积（0.5至10 μL），最终确定了最佳体积为2.5 μL。这一体积在保证HRR区域测序深度的同时，有效降低了HRD区域的测序负担，从而实现了测序效率的最大化。

然而，SPRE-Seq方法也存在一些局限性。首先，该方法的可行性依赖于特定的探针设计和实验条件，因此在实际应用中，需要根据具体的检测目标和样本特性进行调整。其次，链霉亲和素与生物素之间的动态结合特性使得理论计算的最佳体积难以精确确定，必须通过实验进行优化。这可能增加了方法的实施难度，尤其是在大规模应用时，需要更多的实验资源和时间。因此，未来的研究需要进一步探索如何优化这一过程，以减少实验工作量并提高方法的可重复性。

在方法的实际应用中，我们还发现，GC含量对测序深度有显著影响。高GC含量的区域通常难以获得足够的测序覆盖，这可能与DNA双链结构的稳定性有关。因此，在设计探针时，需要充分考虑GC含量的分布情况，尽量避免高GC区域的过度覆盖。然而，由于某些生物功能重要的区域不可避免地具有高GC含量，这些区域在使用SPRE-Seq方法时可能需要特别关注，以确保其检测的准确性。在本研究中，我们使用的HRD探针具有平均42%的GC含量，且未包含高GC区域，因此能够有效避免这一问题。

总体而言，SPRE-Seq是一种可靠、可行且成本效益较高的测序方法，能够在减少测序数据量的同时，实现对关键区域的深度覆盖。这一方法不仅适用于HRD检测，还具有广泛的适用性，可以推广到其他需要差异化测序深度的NGS项目中。通过SPRE-Seq，研究人员可以在有限的资源条件下，更高效地完成复杂基因组变异的检测，为精准医学和个性化治疗提供更精确的基因组数据支持。此外，该方法的灵活性使其能够适应不同类型的测序面板，只要这些面板包含至少两个独立的探针组，便可以应用SPRE-Seq技术。

在实际操作中，SPRE-Seq的实施需要严格遵循实验流程。首先，需要对目标区域的探针进行精确设计，并确保其覆盖所有重要的基因区域。其次，在预处理阶段，必须通过实验确定最佳的链霉亲和素体积，以实现探针的差异化阻断。此外，在样本处理和测序过程中，还需要注意DNA提取的质量和完整性，以及测序平台的选择和参数的优化。这些因素共同影响了最终的测序效果和变异检测的准确性。

本研究的结果表明，SPRE-Seq在实际应用中具有显著的优势。首先，其能够在降低数据量的情况下，保持对关键区域的高测序深度，从而提高变异检测的准确性。其次，该方法能够有效减少冗余测序，提高资源利用效率。最后，SPRE-Seq在临床样本中的表现同样优秀，显示了其在实际应用中的广泛适用性。尽管该方法在某些情况下可能受到GC含量和样本质量的影响，但通过合理的探针设计和实验优化，这些挑战是可以被克服的。

未来的研究可以进一步探索SPRE-Seq在更多类型疾病和基因组区域中的应用。例如，在某些需要检测大量低频变异的癌症类型中，SPRE-Seq可能能够显著提高检测效率。此外，该方法还可以与现有的测序平台和技术相结合，以实现更高效的测序流程。随着NGS技术的不断发展，SPRE-Seq有望成为一种标准的测序方法，为精准医学和基因组研究提供更高效、更精确的数据支持。

综上所述，SPRE-Seq方法在提高测序效率和准确性方面具有重要的应用价值。它不仅解决了传统NGS方法在测序深度与广度之间的权衡问题，还为研究人员和临床医生提供了一种新的工具，以更高效地获取关键基因区域的变异信息。随着该方法的进一步优化和推广，SPRE-Seq有望在未来的基因组研究和临床诊断中发挥更大的作用，推动精准医学的发展。