小胶质细胞Ythdf2缺失通过Ace/Bmp4通路加剧缺血性视网膜病变的机制研究

《Journal of Advanced Research》：Ythdf2 loss in microglia aggravates ischemic retinopathy by increasing microglia activation and microvascular anomalies

本研究聚焦于视网膜微血管疾病中免疫微环境失调的机制，发现m6A阅读器Ythdf2在小胶质细胞中的表达下调是驱动病变的关键因素。通过构建小胶质细胞特异性Ythdf2基因敲除小鼠模型，研究人员揭示Ythdf2缺失会通过增强Ace和Bmp4的mRNA稳定性，诱发小胶质细胞过度活化，进而破坏血-视网膜屏障、延缓生理性血管出芽、加速病理性血管重塑。该研究不仅阐明了Ythdf2-Ace/Bmp4轴在微血管稳态中的新功能，还为糖尿病视网膜病变等疾病提供了潜在治疗靶点。

　　

视网膜是人体唯一能够无创观察微血管结构的窗口，视网膜微血管病变如糖尿病视网膜病变（Diabetic Retinopathy, DR）和早产儿视网膜病变（Retinopathy of Prematurity, ROP）已成为全球致盲的主要原因。微血管功能障碍涉及血管细胞、神经细胞和免疫细胞的复杂相互作用，其中小胶质细胞作为视网膜中主要的常驻免疫细胞，在维持微环境稳态中扮演着"免疫哨兵"的角色。在病理状态下，小胶质细胞异常活化会分泌炎性因子，破坏血管完整性并促进病理性血管新生。然而，调控小胶质细胞活化的深层分子机制尚不明确。

近年来，RNA表观遗传修饰尤其是N⁶-甲基腺苷（m⁶A）修饰被证实在基因表达调控中发挥关键作用。m⁶A修饰由甲基转移酶（"书写器"）、去甲基化酶（"擦除器"）和结合蛋白（"阅读器"）动态调控，其中YTH结构域家族蛋白2（Ythdf2）作为重要的m⁶A阅读器，可通过识别m⁶A标记介导mRNA降解。虽然Ythdf2在糖尿病视网膜病变等血管疾病中已有研究，但其在小胶质细胞中的特异性功能及其在视网膜血管病变中的作用机制仍有待揭示。

为解答这一科学问题，南京医科大学附属第一医院眼科研团队在《Journal of Advanced Research》上发表了最新研究成果。研究人员通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）发现，在氧诱导视网膜病变（Oxygen-Induced Retinopathy, OIR）小鼠模型中，小胶质细胞的Ythdf2表达显著下调。为探究其功能，团队构建了小胶质细胞特异性Ythdf2基因敲除小鼠（Cx3cr1^CreERT2Ythdf2^fl/fl），并系统分析了其在生理性和病理性条件下的表型变化。研究还结合RNA测序（RNA-seq）、甲基化RNA免疫共沉淀（MeRIP）-qPCR、RNA免疫共沉淀（RIP）-qPCR等技术，深入解析了Ythdf2的下游调控网络。

YTHDF2在病变小胶质细胞中下调

通过分析公共数据库GSE132731和GSE152928的单细胞转录组数据，研究发现OIR小鼠视网膜小胶质细胞中Ythdf2表达显著降低。体外实验进一步证实，缺氧处理72小时的原代小胶质细胞中Ythdf2的mRNA和蛋白水平均下降，且单细胞轨迹分析显示Ythdf2表达随病变进展而递减。

小胶质细胞特异性敲除Ythdf2诱导发育期视网膜小胶质细胞活化

RNA-seq分析显示，Ythdf2缺失导致小胶质细胞中538个基因上调、227个基因下调，其中巨噬细胞/小胶质细胞活化相关通路显著富集。qPCR验证发现Ythdf2敲除小胶质细胞的炎症因子（IL-6、Tnf-α、IL-1β）表达升高，静息态标志物（Tmem119、P2ry12）下调，活化态标志物（Cstb、Fabp5、Trem2等）上调。形态学观察发现Ythdf2敲除小鼠在P7和P14时小胶质细胞胞体面积增大、突起减少，呈现典型的活化形态，但至P30时差异消失。

Ythdf2缺失损害发育期视网膜的生理性血管生成

视网膜铺片IB4染色显示，Ythdf2敲除小鼠在P7-P14期间浅层、深层和中间层血管丛的血管密度（血管面积百分比和直径）和复杂度（分支点数量）均降低，血管平均长度增加。至P30时，各层血管网络形态与对照组无显著差异，表明Ythdf2缺失引起的血管发育缺陷具有时间特异性。

Ythdf2缺失 disrupts 血管出芽和重塑

在P7发育高峰期，Ythdf2敲除小鼠视网膜血管径向延伸受阻，内皮尖端细胞数量和丝状伪数量减少。同时，胶原IV⁺IB4^-的空血管鞘数量增加，表明血管修剪加速。这些变化导致发育期血管丛处于低血管化状态。

Ythdf2缺失损害毛细血管形态发生

P7时期Ythdf2敲除小鼠视网膜血管中VE-钙黏蛋白（VE-cadherin）覆盖不连续，周细胞覆盖度（PDGFRβ标记）降低，TER-119⁺红细胞泄漏至血管外，表明血-视网膜屏障（Blood-Retinal Barrier, BRB）功能受损。至P30时，这些异常现象均消失。

Ythdf2缺失加剧OIR视网膜的小胶质细胞活化

在OIR病理模型中，单细胞转录组分析将小胶质细胞分为Ythdf2^高、Ythdf2^中和Ythdf2^低三个亚群。Ythdf2^低群中巨噬细胞趋化通路富集，静息态标志物表达降低而活化态标志物升高。形态学观察发现Ythdf2敲除OIR小鼠在P17、P21和P25时阿米巴样活化小胶质细胞在病理性血管簇周围的聚集显著增加。

Ythdf2缺失加重OIR视网膜的病理性血管新生和BRB破坏

Ythdf2敲除OIR小鼠在P17-P25期间视网膜无血管区面积扩大，病理性血管簇（Neovascular Tufts, NVTs）增多。VE-钙黏蛋白和周细胞覆盖度在NVTs和非NVTs区域均降低，TER-119⁺红细胞泄漏加剧，表明BRB破坏加重。

Ythdf2过表达缓解OIR视网膜的微血管功能障碍

通过玻璃体腔注射携带Iba-1启动子的AAV-Ythdf2病毒，实现小胶质细胞特异性过表达Ythdf2。结果显示Ythdf2过表达可显著缩小OIR视网膜的无血管区和NVTs面积，并减少血管泄漏。

Ythdf2通过调控Ace和Bmp4的mRNA稳定性影响小胶质细胞和血管表型

机制上，研究人员从538个上调基因中筛选出7个与视网膜血管病变相关的候选基因，最终聚焦于血管紧张素转换酶（Angiotensin-Converting Enzyme, Ace）和骨形态发生蛋白4（Bone Morphogenetic Protein 4, Bmp4）。MeRIP-qPCR和RIP-qPCR实验证实Ythdf2直接结合Ace和Bmp4 mRNA的m⁶A位点并介导其降解。放线菌素D实验显示Ythdf2缺失延长了Ace和Bmp4 mRNA的半衰期。在常氧和缺氧条件下，Ythdf2敲除均导致小胶质细胞中Ace和Bmp4的mRNA和蛋白水平上调。

卡托普利或Noggin补充缓解Ythdf2缺失引起的微血管功能障碍

为验证Ace和Bmp4的功能，研究人员对Ythdf2敲除OIR小鼠分别给予卡托普利（Captopril，ACE抑制剂）腹腔注射或Noggin（Bmp4拮抗剂）玻璃体腔注射。结果显示两者均可部分缓解无血管区扩大和NVTs增生，联合使用效果更显著。

本研究首次揭示了小胶质细胞Ythdf2通过Ace/Bmp4通路调控视网膜微血管发育和病变的新机制。研究发现Ythdf2缺失引起的微血管异常具有时间特异性，在发育高峰期（P7-P14）最显著，至成熟期（P30）可代偿性恢复，但这种短暂缺陷可能建立长期脆弱性，类似于早产儿视网膜病变患者终身存在的视觉功能障碍。在病理条件下，持续缺氧使Ythdf2缺失的损害效应被放大，导致不可逆的血管损伤。

该研究的 therapeutic 意义在于为当前抗VEGF疗法的局限性提供了新思路。靶向小胶质细胞Ythdf2-Ace/Bmp4轴可从源头上调控免疫微环境，且卡托普利作为口服降压药具有良好安全性，为糖尿病视网膜病变等疾病的防治提供了新策略。未来研究可进一步探索Ythdf2在其他视网膜细胞中的作用，以及该通路与现有疗法的协同效应。