基于转录组学的抗病毒药物筛选发现ATF6是内质网应激和先天免疫的稳态调节因子

《Journal of Advanced Research》：Transcriptomics-driven antiviral drug screening identifies ATF6 as a homeostatic regulator of ER stress and innate immunity

动态转录组分析揭示ER应激调控宿主抗SARS-CoV-2免疫平衡机制。通过cMap算法结合高通量药物筛选，发现ATF6通过负反馈抑制PERK/IRE1通路，平衡病毒清除与炎症毒性。Sorafenib、Regorafenib等11种化合物有效抑制病毒复制，其中ATF6靶向策略为广谱抗冠状病毒治疗提供新思路。

　　SARS-CoV-2的全球大流行对人类社会和健康体系造成了巨大影响，其传播速度和变异能力使得传统的抗病毒策略面临严峻挑战。面对这一现实，科学家们不断探索新的治疗手段，以期能够有效应对未来可能出现的病毒爆发。传统的药物开发方法通常聚焦于单一靶点，无论是病毒本身还是宿主细胞中的特定因子。然而，这种方法虽然在细胞层面可以显著抑制病毒复制，但在临床应用中却难以保证疗效，并且许多针对宿主靶点的药物往往伴随着较高的毒性和副作用。因此，为了更好地应对未来的病毒威胁，迫切需要一种全面、高效且易于使用的治疗策略。

本研究旨在通过分析“动态病毒-宿主相互作用”来识别宿主细胞中最佳的抗病毒转录组响应，开展大规模的药物筛选，并通过整合药理活性化合物的分析，发现能够抑制病毒复制的全转录组响应或全靶点药物。研究采用了深度RNA测序技术，以Huh7和Vero-E6两种宿主细胞模型来研究病毒感染后基因表达的变化以及病毒复制动力学。这种动态分析方法为理解病毒与宿主之间的复杂相互作用提供了全新的视角。通过这种方法，研究人员能够识别出哪些基因表达模式与抗病毒效果密切相关，并进一步筛选出具有潜在抗病毒活性的化合物。

为了提高药物筛选的效率，研究团队还结合了生物信息学方法和实验验证手段，如CRISPR-Cas9基因编辑技术和Western Blot（WB）分析。这些技术帮助研究人员揭示了药物作用的靶点和其抑制病毒复制的机制。此外，研究还利用了Connectivity Map（cMap）这一计算方法，通过比较化合物诱导的转录组变化与病毒诱导的宿主细胞基因表达变化之间的相似性，预测出具有抗病毒潜力的候选药物。这种方法的核心思想是通过“基因表达特征”来识别能够模拟抗病毒状态的化合物。

研究结果显示，宿主细胞中先天免疫通路的急性激活在抑制SARS-CoV-2复制方面起着至关重要的作用。同时，研究人员成功筛选出多种具有药理活性的化合物。进一步的转录组比较发现，内质网（ER）应激反应是影响这些化合物抗病毒效果差异的关键机制。从机制上看，ATF6作为一种ER应激调节因子，通过抑制PERK/IRE1驱动的快速NF-κB激活和先天免疫反应，促进了病毒复制。这一发现为理解病毒如何利用宿主细胞的应激反应来增强其自身复制提供了新的视角。

此外，研究还揭示了ER应激通路在抗病毒防御和炎症毒性之间起到平衡作用。尽管适度的ER应激有助于维持细胞稳态，但持续的激活则可能导致细胞凋亡，因此需要复杂的ER应激反馈调节。PERK信号通路通过诱导GADD34的表达，促进eIF2α的去磷酸化，从而恢复全局翻译水平。ATF6的激活则通过上调P58^IPK，一种PERK过度激活的关键抑制因子，来调节这一过程。West Nile病毒感染模型显示，ATF6的缺失会增强PERK介导的抗病毒反应，但同时也会加剧细胞死亡，说明ATF6在免疫防御和细胞存活之间起到了平衡作用。这些发现表明，ATF6可能通过间接调控其他ER应激分支来影响先天免疫，但其具体机制尚不明确。

在药物筛选方面，研究团队通过cMap算法对数千种化合物的转录组数据进行了分析，筛选出17种具有潜在抗病毒活性的候选药物。其中，某些药物在Huh7和Vero-E6细胞中表现出不同的抗病毒效果，例如Vinigrol和U0126仅在Vero-E6细胞中显示出抑制病毒复制的能力，而Zardaverine、Ambroxol和Rh2（S）则仅在Huh7细胞中表现出抗病毒活性。这种药物作用的细胞特异性可能与病毒和宿主细胞之间的相互作用有关，也可能是药物筛选过程中出现偏差的原因之一。

为了验证这些候选药物的抗病毒效果，研究团队进行了体外细胞实验，评估了药物对SARS-CoV-2病毒复制的抑制作用，并计算了这些药物对Vero-E6和Huh7细胞的半数抑制浓度（IC50）和半数细胞毒性浓度（CC50）。结果显示，这些药物在不同细胞系中表现出不同的抗病毒能力，表明药物筛选过程中需要考虑细胞类型对药物反应的影响。同时，研究团队还发现某些药物能够有效抑制SARS-CoV-2的不同变种（如Omicron和Delta），说明基于转录组特征的药物筛选策略具有广泛的抗病毒潜力。

进一步的实验分析表明，ER应激通路在病毒复制中起到了关键的调控作用。研究团队通过基因敲除和shRNA技术，探讨了ATF6、PERK和IRE1这三个ER应激分支对病毒复制的影响。结果发现，ATF6的缺失显著抑制了SARS-CoV-2的复制，其效果与ACE2基因缺失相似。同时，ATF6的缺失还导致了炎症因子如IL-1α、IL-1β和TNF-α的表达水平显著升高，这表明ATF6可能通过抑制PERK和IRE1通路的过度激活，从而维持先天免疫的稳态。此外，研究还发现ATF6的激活能够通过调节IRE1和PERK通路，从而抑制NF-κB的激活，这一发现为理解ATF6在病毒复制中的作用提供了新的机制。

通过这些研究，科学家们揭示了ATF6在病毒复制中的双重作用：一方面，它可能通过抑制PERK和IRE1通路的过度激活，从而维持细胞稳态；另一方面，它也可能通过调控先天免疫反应，影响病毒的复制效率。这一发现不仅为抗病毒药物的研发提供了新的思路，也为未来的病毒防控策略提供了理论支持。例如，针对早期感染阶段的患者，使用ATF6抑制剂可能有助于增强先天免疫反应，从而更有效地清除病毒；而对于晚期感染阶段，尤其是出现细胞因子风暴的患者，使用ATF6激活剂可能有助于减少过度的炎症反应，从而降低疾病严重程度。

研究还表明，ER应激通路是一个复杂的调控网络，它不仅参与病毒复制，还与宿主细胞的免疫反应密切相关。例如，研究团队发现，ATF6的缺失不仅抑制了病毒复制，还显著增强了宿主细胞的免疫反应，这种增强效应在不同病毒（如OC43、229E和流感A病毒PR8）感染模型中也得到了验证。这表明，ATF6可能在多种病毒的复制过程中起到关键作用，因此，针对ATF6的调控策略可能具有广泛的抗病毒潜力。

此外，研究还探讨了ATF6在ER应激和先天免疫反应之间的具体作用机制。通过使用特定的化学抑制剂和激活剂，研究人员发现ATF6的缺失会导致IRE1和PERK通路的过度激活，从而增强NF-κB信号通路的活性。这一现象在多种细胞模型中得到了验证，包括Huh7和Vero-E6细胞。同时，研究还发现ATF6的激活能够通过调控IRE1和PERK通路，从而抑制NF-κB的激活，这种调控作用可能与ATF6的转录激活域有关。这些发现不仅揭示了ATF6在病毒复制中的作用机制，也为未来的抗病毒药物设计提供了新的思路。

总的来说，这项研究通过深度RNA测序和cMap算法，揭示了宿主细胞中抗病毒转录组特征与药物作用之间的关联。研究团队不仅成功筛选出多种具有抗病毒活性的化合物，还深入探讨了ER应激通路在病毒复制中的作用机制，特别是ATF6在调控PERK和IRE1通路中的关键角色。这些发现为未来的抗病毒药物开发提供了重要的理论依据和实验支持，同时也为理解病毒与宿主细胞之间的相互作用提供了新的视角。通过这些研究，科学家们希望能够开发出一种更加全面、高效且具有广泛适用性的抗病毒策略，以应对未来可能出现的病毒大流行。