Oct4通过MORE序列空间选择性招募HBO1组蛋白乙酰化酶复合体调控转录的新机制

《Journal of Biological Chemistry》：Jade1 and the HBO1 histone acetyltransferase complex are spatial-selective cofactors of the pluripotency transcription factor Oct4

本研究针对转录因子Oct4如何依据其DNA结合构象差异性地招募辅因子这一关键科学问题，开展了Oct4与HBO1组蛋白乙酰化酶复合体相互作用的研究。研究人员发现Jade1是Oct4在结合MORE（更回文八聚体相关元件）DNA序列时的特异性互作蛋白，并揭示Oct4的N端结构域反而抑制该互作。通过ChIP-seq、体外HAT实验及冷冻电镜技术，证实Oct4-MORE-HBO1/Jade1复合体能特异性增强核小体H3K9乙酰化，并引起局部DNA解旋。该研究首次阐明了Oct4通过其DNA结合构象选择性招募染色质修饰复合体的精确机制，对理解多能性调控的转录编码具有重要意义。

　　

在生命科学的宏伟蓝图中，细胞身份的决定是一个核心谜题，而掌握这把钥匙的正是被称为“主调控因子”的转录因子。其中，Oct4（也称为Pou5f1）尤为耀眼，它是维持胚胎干细胞（ESC）多能性——即分化成体内任何类型细胞能力的绝对核心。如同一个乐队的指挥，Oct4通过开启或关闭特定基因的表达，精确地指挥着细胞的生命进程。然而，一个长期困扰科学家们的难题是：同一个Oct4蛋白，如何能够调控成百上千个功能各异的靶基因，并产生如此多样化的转录输出？

传统观点倾向于认为，这种特异性的实现依赖于Oct4与其他不同转录因子（如Sox2）的协同作用，或者其所处细胞环境的差异。但近年来，另一种颇具吸引力的假说逐渐浮出水面：Oct4本身与DNA结合的方式并非一成不变。它不仅能以单体形式结合经典的八聚体 motif（5‘-ATGCAAAT-3’），还能在一种名为MORE（更回文八聚体相关元件）的特殊DNA序列上，以独特的二聚体构象结合。这种构象变化会暴露或隐藏蛋白质表面的特定区域，从而像切换钥匙一样，潜在地招募不同的“帮手”——即转录辅因子。然而，这种“空间选择性”招募的具体机制及其功能重要性，在很大程度上仍是一个未知的黑色盒子。

为了揭开这个黑盒子的秘密，由Yifan Wu、Asit K. Manna、Li Li、Zuolian Shen、Hiroshi Handa、Mahesh B. Chandrasekharan和Dean Tantin组成的研究团队在《Journal of Biological Chemistry》上发表了一项突破性研究。他们的工作首次鉴定出Jade1及其所在的HBO1组蛋白乙酰转移酶（HAT）复合体是Oct4在MORE序列上的特异性辅因子，并详细阐释了其分子机制和功能后果，为理解转录因子的构象依赖性功能提供了全新的范式。

研究人员综合运用了DNA亲和纯化结合质谱分析、免疫共沉淀、染色质免疫共沉淀测序（ChIP-seq）、体外组蛋白乙酰化转移酶（HAT）活性分析、凝胶迁移或变动分析（EMSA）以及单颗粒冷冻电镜（cryo-EM）等关键技术方法。研究主要使用了Oct1基因缺陷的小鼠胚胎干细胞（ESC）模型，以避免Oct1同源蛋白的干扰，并通过Expi293F细胞系统表达和纯化重组蛋白用于生化分析。

Oct4 DNA亲和纯化鉴定Jade1为空间选择性相互作用伙伴

为了系统性寻找依赖于Oct4 DNA结合构象的相互作用蛋白，研究人员设计了一种巧妙的策略。他们将包含多拷贝经典八聚体序列或MORE序列的DNA片段固定在小磁珠上，然后与缺失Oct1的小鼠胚胎干细胞提取物共同孵育，从而特异性捕获与特定DNA序列结合的Oct4及其复合物。通过质谱分析，他们发现绝大多数与Oct4结合的蛋白具有序列特异性：89.5%的八聚体序列结合蛋白和76.9%的MORE序列结合蛋白是互不重叠的。在MORE序列特异性结合的蛋白中，一个名为Jade1的蛋白引起了研究人员的注意。Jade1是HBO1组蛋白乙酰化酶复合体的一个关键支架组分。随后的免疫印迹验证实验确认，Jade1确实只在与野生型MORE序列DNA结合的复合物中被显著富集，而在突变型MORE或八聚体序列上则没有。通过免疫共沉淀实验，研究人员在细胞水平证实了Oct4与Jade1之间的直接相互作用。

Oct4与Jade1相互作用

深入研究Oct4与Jade1相互作用的细节时，一个出乎意料的发现出现了。通常，转录因子的N端激活结构域被认为是招募激活类辅因子的关键区域。然而，当研究人员构建了缺失N端130个氨基酸的Oct4截短体（ΔN Oct4）时，发现该突变体不仅没有失去与Jade1的结合能力，反而表现出更强的相互作用。在体外DNA pull-down实验中，缺失N端的Oct4能更有效地将Jade1招募到MORE DNA上。相反，单独表达Oct4的N端结构域则会抑制这种增强的招募。这表明Oct4的N端并非Jade1的招募界面，反而扮演了一个“自动抑制”的角色，在Oct4结合经典八聚体时，其N端可能阻碍了Jade1的接近，而当Oct4以二聚体形式结合MORE时，其构象变化可能解除了这种抑制。

Jade1/HBO1复合体偏好结合于MORE位点

为了在基因组层面验证上述发现，研究人员进行了HBO1（该复合体的催化亚基）的ChIP-seq分析。结果显示，在胚胎干细胞中，HBO1的结合峰有相当一部分（1744个）与已知的Oct4结合峰重叠。更重要的是，当专门分析这些重叠区域时，DNA序列 motif 分析显示MORE序列被显著富集；而在所有Oct4结合位点（包括不与HBO1重叠的位点）中，经典八聚体 motif 则更为常见。这表明在细胞内，HBO1复合体确实被优先招募到Oct4结合的MORE位点附近。功能上，当研究人员在胚胎干细胞中敲低Jade1后，发现位于含有MORE序列的Polr2a基因区域的组蛋白H3第9位赖氨酸乙酰化（H3K9Ac）水平显著下降，而在含有经典Oct-Sox结合元件的Pou5f1增强子区域，H3K9Ac水平则未受影响。这直接证明了Jade1/HBO1复合体负责在Oct4结合的MORE位点特异地催化H3K9乙酰化。

Oct4增强HBO1/Jade1L复合体对组蛋白H3K9的乙酰化

为了在更纯净的体系中验证Oct4的构象如何直接影响HBO1的酶活性，研究人员在体外重构了整个反应系统。他们纯化了重组Oct4蛋白、Jade1L/HBO1/ING4/hEaf6复合体，以及包含MORE序列的核小体。体外组蛋白乙酰化实验显示，纯化的HBO1/Jade1复合体能够有效乙酰化核小体上的组蛋白H4（H4K5， H4K8， H4K12）。令人惊讶的是，当Oct4存在并与MORE序列结合时，H4的乙酰化水平没有增强，但H3K9的乙酰化水平却显著提高。这表明Oct4的招募特异性地改变了HBO1复合体的催化偏好，使其转向H3K9。

一个能更有效结合MORE的Oct4突变体在存在HBO1/Jade1L复合体时能更有效地乙酰化核小体

为了进一步证实结合强度与催化活性之间的因果关系，研究人员利用了一个已知的Oct4点突变体（Oct4^S229D）。该突变模拟了其同源蛋白Oct1中一个能稳定MORE结合构象的磷酸化修饰。正如预期，Oct4^S229D相比野生型Oct4，对MORE DNA的结合亲和力更高，能形成更多的二聚体-DNA复合物。相应地，在体外HAT实验中，Oct4^S229D突变体也表现出更强的促进H3K9乙酰化的能力，并且这种促进作用呈现剂量依赖性。这强有力地证明，Oct4对MORE的结合能力直接决定了其招募和调控HBO1复合体进行H3K9乙酰化的效率。

HBO1/Jade1/ING4/hEaf6复合体和Oct4^S229D在核小体存在下的冷冻电镜结构

最后，为了从结构上窥见这一复合体的组装方式，研究人员利用冷冻电镜技术解析了Oct4^S229D、HBO1/Jade1/ING4/hEaf6复合体与MORE核小体形成的超大复合物的三维结构。虽然分辨率（7.2 ?）不足以构建原子模型，但重构的电子密度图揭示了关键信息。密度图显示，在核小体核心颗粒周围出现了额外的质量，对应于结合的HBO1复合体。更重要的是，可以观察到核小体入口/出口处的DNA发生了部分解旋，形成了一个延伸的密度区域，研究人员成功地将已知的Oct4二聚体DNA结合域结构模型拟合到该区域。这直观地展示了Oct4结合MORE如何引起局部染色质结构的改变，为HBO1复合体接近组蛋白尾部并催化乙酰化创造了条件。

综上所述，这项研究得出了几个核心结论：首先，Jade1是Oct4在结合MORE DNA序列时的空间选择性辅因子。其次，Oct4的N端结构域非但不是招募所必需，反而起自抑制作用。第三，基因组学和生化实验证实，Oct4-MORE-Jade1/HBO1这一通路特异性导致组蛋白H3K9的乙酰化。第四，Oct4对MORE的结合强度直接决定了其激活H3K9乙酰化的效能。最后，结构数据表明Oct4结合MORE能引起核小体DNA的解旋，并与HBO1复合体共同组装在核小体上。

这项研究的讨论部分强调了其深远意义。它首次提供了令人信服的证据，表明同一个转录因子Oct4，仅仅通过改变其与DNA结合的构象（单体 vs. 二聚体，经典八聚体 vs. MORE），就能像切换开关一样，招募功能迥异的辅因子复合体——在经典位点可能倾向于招募抑制性复合物，而在MORE位点则特异性招募HBO1这样的激活性复合物。这不仅解释了Oct4多功能性的一个新机制，也将POU蛋白家族确立为研究转录因子“构象功能编码”的典范。此外，该研究揭示了在多能性调控和广泛表达的看家基因（如Polr2a）表达中，H3K9乙酰化这一特定修饰可能扮演了此前未被重视的激活角色。这些发现深化了对多能性调控和转录机制的理解，并为未来干预相关疾病（如利用HBO1抑制剂靶向白血病干细胞）提供了新的理论基础和潜在的靶点视角。