连接蛋白半通道对小分子通透选择性的分子机制：N末端电荷与TM2相互作用的关键作用

《Journal of Biological Chemistry》：Mechanisms of permselectivity of connexin hemichannels to small molecules

本研究针对连接蛋白半通道对小分子代谢物（如ATP、谷氨酸和乳酸）的通透选择性机制不明确的问题，通过共表达遗传编码的荧光传感器（GRABATP、iGluSnFR、eLACCO1.1）和多种连接蛋白（Cx26, Cx32, Cx43, Cx31.3, Cx36, Cx46, Cx50），在生理性刺激（CO2和去极化）下系统评估了不同半通道的通透特性。结果发现连接蛋白半通道可分为相对非选择性（如Cx26, Cx32, Cx43）和高度选择性（如Cx36, Cx46, Cx50）两类，且通透性受门控刺激方式影响。通过Cx46和Cx50的突变分析，揭示了N末端净电荷及其与TM2的相互作用是决定ATP通透选择性的关键因素。该研究深化了对连接蛋白功能多样性的理解，为相关生理病理过程提供了新见解。

　　

在我们身体的细胞之间，存在着一种至关重要的通讯方式，它不依赖于神经递质或激素的快速作用，而是通过一种名为连接蛋白（Connexin）的分子机器所形成的通道来实现。连接蛋白可以组装成两种形式的通道：当两个相邻细胞的半通道（Hemichannel）对接时，它们形成间隙连接通道（Gap Junction Channel），允许离子和小分子直接在两细胞间穿梭；而当半通道独立存在于细胞膜上并朝向细胞外空间开放时，它们则成为半通道，介导细胞内容物（如ATP、谷氨酸、乳酸等）向细胞外的释放。人体内存在21种不同的连接蛋白基因，它们广泛表达于各种组织器官，参与调控从细胞代谢、信号传导到组织发育等多种生理过程。然而，一个长期悬而未解的核心科学问题是：这些结构相似的连接蛋白半通道，在允许小分子通过时，是否具有选择性？如果存在选择性，其分子决定因素又是什么？传统观点认为，半通道更像是一个简单的分子筛，主要根据分子大小来限制通透，分子量小于约1000道尔顿的分子似乎都可以通过。但越来越多的证据暗示，实际情况可能远比这复杂。例如，不同的生理性刺激（如二氧化碳分压PCO₂的变化或细胞膜电位去极化）打开通道时，通道的构象可能不同，这会不会影响其对不同分子的通透性？此外，以往研究多采用去除细胞外钙离子（Ca²⁺）这种非生理性的方法来强行打开半通道，并用荧光染料来评估通透性，这些方法是否能真实反映生理条件下对ATP、谷氨酸、乳酸等重要代谢物或信号分子的通透特性，也值得商榷。澄清连接蛋白半通道的通透选择性机制，对于理解其在特定组织（如神经元、晶状体）中的精确生理功能以及相关疾病（如听力损失、白内障、神经疾病）的病理机制至关重要。

为了回答这些关键问题，来自华威大学的研究团队在《Journal of Biological Chemistry》上发表了一项深入研究。他们开发了一种创新的实时成像检测方法，能够在单细胞分辨率下监测分析物的释放。该研究的核心策略是利用遗传编码的荧光传感器，这些传感器能特异性地、高灵敏度地检测ATP（使用GRAB_ATP传感器）、谷氨酸（使用iGluSnFR传感器）和乳酸（使用经过改造的eLACCO1.1传感器）。研究人员将不同的连接蛋白（包括Cx26, Cx32, Cx43, Cx31.3, Cx36, Cx46, Cx50）与这些传感器共表达在几乎不表达内源性连接蛋白的HeLa DH细胞中。然后，他们应用生理范围内的刺激来打开半通道：一是改变CO₂分压（PCO₂，例如从20 mmHg升至55 mmHg），这能特异性激活那些具有CO₂敏感性的连接蛋白（如Cx26, Cx32, Cx43, Cx50）；二是使用高钾溶液引起细胞膜去极化，这能电压门控性地打开大多数连接蛋白半通道。通过比较不同刺激下ATP、谷氨酸和乳酸的释放量，并对照其电化学驱动力，研究人员得以系统评估各种连接蛋白半通道的通透选择性模式。

关键技术方法概述

本研究主要关键技术包括：利用分子克隆技术构建并突变（如Gibson组装）多种连接蛋白（Cx26, Cx32等）的cDNA，并将其亚克隆到带mCherry标签的pCAG-GS载体中；使用PEI转染法将连接蛋白载体与遗传编码荧光传感器（GRAB_ATP, iGluSnFR, eLACCO1.1）载体共转染至HeLa DH细胞（细胞来源明确为ECACC 96112022）进行表达；通过活细胞荧光成像技术（Epifluorescence imaging），在精确控制细胞外液（aCSF，能调控PCO₂和K⁺浓度）的条件下，实时记录传感器荧光变化（ΔF/F₀）以量化分析物释放；采用染料负载实验（FITC loading assay）验证通道开放程度；通过共聚焦显微镜（Confocal microscopy）和Manders‘共定位分析（使用DiO膜染料）评估蛋白质的膜定位；并运用非参数统计方法（如Kruskal-Wallis检验、Mann-Whitney U检验）进行数据分析。

Cx26, Cx32, Cx43和Cx31.3半通道对ATP、谷氨酸、乳酸均具有通透性

研究人员首先证实，在共表达Cx26和传感器的HeLa细胞中，无论是高碳酸血症刺激（55 mmHg PCO₂）还是去极化刺激（50 mM KCl），都能引发ATP、谷氨酸和乳酸的显著释放。然而，刺激方式影响释放效率，例如对于Cx26，去极化刺激对乳酸释放无效。Cx32半通道也对三种分析物均通透，但在高碳酸血症刺激下，谷氨酸和乳酸的释放量远高于ATP，超出了单纯由电化学驱动力所预测的比例，提示Cx32在高CO₂下对这些小分子具有增强的通透性。Cx43半通道在高碳酸血症刺激下，三种分析物的释放比例与其电化学驱动力预测基本一致，表现为相对非选择性。但当使用去极化刺激时，谷氨酸释放减少，乳酸则完全不释放，表明门控机制显著改变了Cx43的通透特性。值得注意的是，当使用传统的低细胞外Ca²⁺方法打开Cx43半通道时，所有分析物的释放量都大幅减少，这解释了本研究与先前一些使用该方法的报道结果存在差异的原因。对于不感受CO₂的Cx31.3，去极化刺激能引发ATP、谷氨酸和乳酸的释放，但其对ATP表现出一定的偏好性。这些连接蛋白被归类为“相对非选择性”半通道。

Cx36, Cx46和Cx50半通道具有高度特异性的通透谱

与上述结果形成鲜明对比的是，高度选择性的半通道表现出截然不同的通透特性。Cx36半通道（对CO₂不敏感，使用去极化刺激）只允许ATP通过，而对分子更小、电化学驱动力更大的谷氨酸和乳酸完全不通透。同样，Cx46半通道（也对CO₂不敏感）也仅通透ATP，不通透谷氨酸和乳酸。最令人惊讶的发现来自Cx50，其半通道在高碳酸血症或去极化刺激下，允许谷氨酸和乳酸通过，但对ATP却完全不通透。这是首次发现存在对ATP不通透的连接蛋白半通道。这些结果强有力地表明，分子大小并非连接蛋白半通道通透性的唯一决定因素，通道内部必然存在某种选择性过滤机制。

Cx46和Cx50半通道差异通透性的突变分析

鉴于Cx46和Cx50在结构上高度同源，但通透谱却完全相反（Cx46通ATP不通小分子，Cx50通小分子不通ATP），它们为研究通透选择性的分子机制提供了理想模型。序列比对显示，两者的N末端净电荷存在差异（Cx46为0，Cx50为-2）。研究人员通过定点突变，将Cx50的N末端残基向Cx46对应残基改造。结果显示，单个点突变（如Cx50^N9R, Cx50^E13N）即可使Cx50半通道获得ATP通透性，而双突变（Cx50^{N9R E13N}）则使其ATP释放量达到与Cx46野生型相当的水平。这表明N末端的净电荷是控制Cx50对ATP通透性的关键因素。然而，反向实验——将Cx46的N末端改造成Cx50样（Cx46^{R9N N13E}）却并未削弱其ATP通透性，提示还有其他因素参与调控。考虑到N末端与第二个跨膜螺旋（TM2）的相互作用对通道功能的重要性，研究人员进一步分析了可能参与此相互作用的残基。他们在Cx46中引入了双突变（Cx46^{A14V T89S}）以模拟Cx50中的相应相互作用，此突变本身不影响ATP通透性。但当把这两个突变与N末端电荷突变结合，构建四重突变体Cx46^QM (R9N, N13E, A14V, T89S)时，ATP的通透性显著降低。通过染料负载实验证实，Cx46^QM半通道对FITC染料的通透性未受显著影响，且并未获得对谷氨酸的通透性，说明该突变体对ATP通透性的抑制具有一定的选择性，而非导致通道整体通透性下降。膜定位分析也排除了突变影响蛋白质运输的可能性。

研究结论与意义

本研究系统阐明了不同连接蛋白半通道对关键生理代谢物（ATP、谷氨酸、乳酸）的通透选择性存在显著差异，并可根据其特性分为相对非选择性和高度选择性两类。这一选择性特征可能与连接蛋白的生理功能相匹配。例如，神经元中丰富的Cx36半通道不通透谷氨酸，可能有助于防止神经递质的非特异性泄漏，确保突触信号传递的精确性；而晶状体中Cx46和Cx50的不同通透性（Cx46通ATP，Cx50不通ATP但通乳酸/谷氨酸）可能适应了晶状体纤维细胞缺乏线粒体、ATP稀缺的特殊代谢环境。研究还揭示了门控刺激方式（如CO₂ vs 去极化 vs 低Ca²⁺）能够改变某些连接蛋白（如Cx32, Cx43）半通道的通透谱，这表明半通道可能存在多种开放的构象状态，其通透特性并非固定不变。

最重要的发现在于，通过巧妙的突变分析，研究确定了N末端的净电荷以及N末端与TM2之间的相互作用是控制半通道对ATP通透选择性的关键分子决定因素。这不仅深化了对连接蛋白孔道性质的基本认识，而且为理解连接蛋白功能多样性提供了新的机制性解释。由于连接蛋白突变与多种人类疾病（如遗传性听力损失、周围神经病变、白内障等）密切相关，阐明其通透选择性的分子基础，有助于未来针对特定连接蛋白功能异常开发更精准的治疗策略。该研究将遗传编码传感器技术与生理性通道门控刺激相结合，为在更接近生理的条件下研究膜通道功能树立了范例，推动连接蛋白研究进入一个更精细、更功能相关的新阶段。